李彦　吕纯莉　肖代敏

【中图分类号】R734.2 【文献标识码】B 【文章编号】2095-6851（2018）06--01

CIK细胞又称自然杀伤样T淋巴细胞，是新一代过继性免疫治疗的首选方案，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、毒性小、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感等优点[1-2]，是目前发现的杀瘤活性最强的免疫效应细胞之一。目前认为，CD3+CD56和CD3+CD8+表型T淋巴细胞是CIK群体中的主要效应细胞，发挥着重要的抗肿瘤作用。参芪扶正注射液是中药类新药，具有显著的免疫调节作用[3]。本研究利用參芪扶正注射液的特性，将其添加于临床应用的CIK培养体系，探讨中药联合CIK抗肿瘤作用的免疫学机制，旨在为CIK细胞培养寻找更优化的路径和方法。

一材料与方法

1.材料与试剂

收集癌症病人全血25ml；淋巴细胞分离液（Ficoll）：天津太平洋科技有限公司；参芪扶正注射液：丽珠集团利民制药厂；抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-APC、CD56-FITC 抗体：美国Becton Dickinson公司。

2.方法与步骤

2.1 CIK细胞的制备

取肿瘤患者的外周血25ml，按2：1的比例用PBS稀释血液，再加等体积的淋巴细胞分离液，2000rpm离心20min，小心吸取白膜层于50ml离心管中，加入PBS，1200 rpm离心5 min，弃上清，用含有10%胎牛血清的GT-T551培养基悬浮细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，接种于培养瓶中，加入终浓度为1000U/ml的IFN-γ，置于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。培养24 小时后加入浓度为50 ng/ml的CD3单抗和300 U/ml 的IL-2，每3 天换液同时补充300 U/ml IL-2。

2.2 实验分组

实验分为三组，分别是对照组、50μl参芪组、100μl参芪组。对照组按CIK细胞制备方法培养；50μl参芪组和100μl参芪组按CIK细胞制备方法培养的同时分别加入50μL/ml和100μL/ml参芪扶正注射液。

2.3 CIK细胞增殖测定

在细胞培养的第6天和第12天分别取各组培养的细胞悬浮液，用台盼蓝染色法计数CIK细胞，并除以第0天的初始细胞数，得出实际的增殖倍数。

2.4 细胞表型分析测定

分别收集诱导培养前单个核细胞悬液和诱导培养12天的各组CIK细胞悬液，调节细胞数为2.0×106/ml以上，用PBS 1000 rpm离心洗涤一次，弃掉上清，分别加入抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-APC、CD56-FITC、抗体及其同型对照，用流式细胞仪检测分析。

2.4 统计学方法 采用SPSS21.0统计分析软件处理。

二.结果

1、CIK细胞增殖倍数。对照组、50μl参芪组、100μl参芪组的细胞增殖倍数均随着培养天数的增加而增加，12天达到最高。由表1可知，参芪组及对照组在第6天、第12天上的细胞增殖倍数均高于第0天时，且差异显著。和对照组比，50μl参芪组在6天和12天时间点增殖倍数为对照组的1.15倍和1.21倍，100μl参芪组增值效应为对照组的1.35倍和1.32倍，均比对照组高。

2、细胞表型分析。与诱导前相比较，对照组和参芪组的CD3+CD4+表达减少，且差异显著（P<0.05）；而CD3+、CD3+8+、CD3+CD56+则表达均有不同程度升高，50μl参芪组能显著提高CIK细胞CD3+、CD3+8+的表达（P<0.05），100μl参芪组则能显著提高CIK细胞CD3+、CD3+8+、CD3+CD56+的表达（P<0.05）

三.讨论

本实验在体外诱导CIK培养后第6天、第12天通过对其计数，发现因子组和参芪组细胞数随着时间的增加而增加，100μl参芪组12天时细胞增殖245.00±56.86倍，明显比因子组增殖倍数多，说明参芪扶正注射液能够促进CIK细胞增殖，从而增加了CIK细胞的抗肿瘤效应。CIK细胞主要效应细胞为CD3+、CD56+T 淋巴细胞，其可释放大量具有细胞毒性的胞浆颗粒对靶细胞发挥溶细胞作用[6]。本实验通过流式细胞仪对培养12天后的CIK细胞表型进行测定，发现培养12天后的CIK细胞各组中CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+比诱导前呈现出增高的趋势，且参芪组比因子组增加更多。说明添加参芪扶正注射液培养的CIK细胞有利于增强CIK细胞的细胞毒活性，从而提高CIK细胞的抑瘤作用和杀伤活性。参芪扶正注射液具有提高机体免疫力，改善机体抗病能力的作用，而CIK细胞又具有杀瘤活性高，杀瘤谱广的特点。将参芪扶正注射液参与刺激诱导CIK细胞的培养，能提高CIK细胞体外增殖能力和CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞的百分率，从而提高CIK细胞的的抗肿瘤效应。

参考文献

秦福丽.PHA 对CIK 细胞增殖和免疫表型影响的研究[J].现代免疫学，2004；25（ 5）：421-425.

黄朝晖.人外周血细胞因子诱导的自然杀伤细胞的体外高效扩增[J].现代免疫学，2004； 24（ 5） ： 395 - 400.

陆益，陆益线.参芪扶正注射液的药理作用和临床应用[J].时珍国医国药，2006，17（10）：2083-2086