刘雪莹 彭欢 林曦 徐华生 黄旋平

p16 基因已被证实参与了细胞的周期调控，肿瘤的发生与其失活导致相关蛋白蛋白合成减少密不可分。p16基因甲基化是p16基因失活的主要方式，造成了肿瘤的发生。该文在实验中选择了具有逆甲基化及抑制甲基化的5-氮-2’-脱氧胞苷(地西他滨,DAC)，未配备载药系统的DAC有效性差，主动吸附靶标的几率小。叶酸受体被证实大量存在于恶性肿瘤细胞中，所以鉴于这些特点利用叶酸壳聚糖纳米颗粒携DAC以提高有效性。本实验探索叶酸-壳聚糖携DAC纳米粒对比DAC作用于人鳞状上皮舌癌细胞SCC-9细胞p16基因甲基化还原效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料

SCC-9细胞(上海酶研生物科技有限公司)；DAC(上海源叶生物科技有限公司)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(TaKaRa公司,日本);甲基化荧光PCR试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)、p16基因引物(大连宝生物公司)；Human β-actin (北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；一抗p16/mts1抗体、二抗兔抗人kit、DAB显色剂(中衫生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养

10%血清DEMN培养基，贴壁培养SCC-9细胞培养于37 ℃、5%CO2培养箱，2～3 d换液并适时传代，待其处于生长对数期备用。

1.3 叶酸壳聚糖载药DAC纳米颗粒制备

100 mg叶酸加合适剂量的蒸馏水，搅动下逐滴加入氨水；0.45 μm滤膜过滤，蒸馏水定容至100 ml，得叶酸氨盐溶液。400 mg壳聚糖加合适剂量的蒸馏水与2 ml冰醋酸磁力搅拌，醋酸的浓度应为1%。0.45 μm滤膜过滤与蒸馏水配至200 ml获2 mg/ml壳聚糖醋酸。合适剂量DAC与已配置的200 ml的壳聚糖醋酸液混合以1 000 r/min速度磁力下进行搅拌，加入50 ml叶酸氨盐溶液与20 ml 2 mg/ml三聚磷酸钠溶液，均按1 滴/s的速度，获得载药地西他滨的叶酸-壳聚糖纳米粒水分散体系。……