宋文 何鲁江

目前，一般检测盐酸克仑特罗的快速诊断试剂条采用的方法是胶体金检测法，该方法虽然能满足快速现场检测的要求，但是只能定性判断样品的阴、阳性，而时间分辨微球检测试剂条可以实现现场的快速定量检测。时间分辨荧光微粒是将镧系稀土元素Eu3+、Tb3+等填入高分子纳米微粒内制成。将其用于免疫分析中，则是将蛋白共价交联在纳米微球表面的化学基团上，通过免疫反应和待检物结合，通过测定荧光强度来推算待检物的浓度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阳性尿样、阴性尿样、时间分辨微球（长沙特优异）、酪蛋白、Tris、BSA、Borax等化学试剂（购自Sigma）。盐酸克仑特罗单克隆抗体、盐酸克仑特罗BSA偶联物（购自杭州隆基生物）。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机（湘仪）、超声波细胞粉碎仪（宁波新芝）、旋转混合仪（宁波新芝）、时间分辨读卡仪（苏州和迈）。

1.3 方法

1.3.1 盐酸克仑特罗的标记时间分辨微球

1.3.1.1 配置标记使用的缓冲液

Buffer A：50mM MES溶液（pH6.0）;

Buffer B：0.23% Tris+0.25% casein（pH8.0）;

Buffer C：0.76% Borax（pH9.0） ;

Buffer D：0.76% Borax+0.25% Casein。

1.3.1.2 微球標记抗体

①100μL直径200nm的时间分辨微球，原始浓度1%（W/V），稀释到900μL Buffer A中;

②15000rpm离心20min，去上清;

③加入1000μL Buffer A，使用移液枪吹打混匀;

④15000rpm离心20min，去上清;

⑤加入1000μL Buffer C，超声2min（功率30%，超声5s，间歇5s，温度设定10℃宁波新芝JY92-IIN，2号变幅杆）;

⑥配置50mg/mL EDAC溶液（使用纯化水溶解），配置50mg/mL NHS溶液（使用纯化水溶解），以上溶液现配现用。

⑦在稀释、超声好的1000μL微球溶液（0.1%W/V）中加入10μL EDAC溶液以及20μL NHS溶液，震荡混匀（旋涡混匀器）5min后，再用旋转混匀仪旋转混匀25min（室温条件）;

⑧15000rpm离心20min，去上清;

⑨加入1000μL Buffer C，使用移液枪吹打混匀后超声2min（功率65%，超声5s，间歇5s，温度设定25℃）;

⑩15000rpm离心20min，去上清;

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