王 玮

(安阳师范学院，河南 安阳 455000)

研究证明，糖尿病患者骨代谢易紊乱，常常并发糖尿病骨质疏松(DOP)，其骨折和致残性较高。目前关于DOP问题，大都从高血糖环境、糖基化终末期产物、胰岛素、微量元素等角度入手进行防治〔1，2〕；而对于肥胖型糖尿病患者，也有从瘦素、脂联素的角度入手〔3〕。间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞，在一定的诱导条件下，MSCs具有向成骨细胞分化的功能〔4〕。本研究从骨髓MSC(BMSC)的角度入手，旨在探究糖尿病大鼠BMSC向成骨细胞分化能力的改变，同时观察中等强度运动对糖尿病大鼠BMSC的成骨诱导能力是否存在有影响，为运动干预DOP提供一定参考依据。

1 资料与方法

1.1动物建模与分组 40只6周龄雄性清洁级SD大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。按体重分层分为对照组(n=8)和糖尿病建模组(n=32)。对照组用普通饲料喂养；糖尿病建模组用高脂饲料(饲料配方：2.5%胆固醇，1%胆酸钠，10%白糖，10%猪油，66.5%普通饲料)喂养8 w后以30 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建糖尿病模型。注射STZ后的第3天和第7天测空腹血糖，空腹血糖>11.1 mmol/L视为建模成功，将建模失败的大鼠(n=15)剔除。随后将建模成功的大鼠按体重分层分为糖尿病组(n=9)和糖尿病运动组(n=8)，均改为普通饲料喂养。

1.2运动方案 糖尿病运动组参照Petzinger等〔5〕进行跑台运动干预，跑台坡度为0°，每周运动6 d，周日休息，运动方案为第1周15 m/min 30 min、第2周15 m/min 60 min、第3周20 m/min 60 min、第4周20 m/min 90 min。

1.3动物取材 运动结束后，于处死当天称重。乙醚麻醉，大鼠心脏取静脉血死亡，每组取5只右侧胫骨提取BMSC，加2 ml红细胞裂解液，进行破红处理。其中2只右腿胫骨的细胞以每孔5×106的密度铺于6孔板上，利用平板计数法(CFU)检测其增殖情况；3只右腿胫骨BMSC分别种至大皿中，体外分离培养，7 d后提取BMSC 中总RNA用RT-PCR法检测Runt 相关转录因子(Runx)2、核因子κB受体活化因子(RANK)和RANK配体(L)mRNA的表达。

1.4CFU形成实验和碱性磷酸酶(ALP)染色 细胞培养5 d后，培养基由低糖换成成骨诱导培养液；培养2 d后，将6孔板从温箱取出，1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，4%多聚甲醛(PFA)固定20 min后，1×PBS洗3次，避光加ALP染料30 min后，1×PBS洗一次，加1×PBS后进行扫描。

1.5BMSC Runx2、RANK和RANKL mRNA定量检测 将种植于大皿的BMSC 7 d后按照RNA的提取步骤，提取RNA。经过酶标仪检测出每个样本RNA的纯度和浓度后，按照反转录试剂盒步骤，将RNA 反转录为cDNA。利用试剂盒，对样本中Runx2 mRNA、RANK mRNA和RANKL mRNA进行定量检测。在Pubmed数据库查询大鼠Runx2、RANK、RANKL和GAPDH基因引物序列，后用Primer Express3.0 软件检测引物(表1)，引物由谷歌生物公司合成。

1.6统计学方法 应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。

表1 RT-PCR 引物序列

2 结 果

2.1各组体重比较 建模成功开始运动时，糖尿病组、糖尿病运动组体重与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但糖尿病组和糖尿病运动组体重差异无统计学意义(P>0.05)；1 w后，糖尿病组体重较对照组显著偏低(P<0.01)，糖尿病组和糖尿病运动组之间仍未出现差异；2 w后各组体重和1 w后的结果一致；3 w后，糖尿病组体重较对照组显著偏低(P<0.01)，糖尿病组和糖尿病运动组体重出现差异，糖尿病运动组偏低(P<0.05)；4 w跑台运动结束后，糖尿病组体重较对照组显著偏低(P<0.01)，糖尿病组和糖尿病运动组无显著差异(P>0.05)。见表2。

2.2CFU形成实验和ALP染色 糖尿病运动组6孔板的成骨细胞数目最多，并且显著多于糖尿病组，表明运动可以促进糖尿病组BMSC体外诱导分化为成骨细胞。见图1。

表2 各组体重比较

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与糖尿病组比较：3)P<0.05

2.3BMSC Runx2、RANK和RANKL mRNA的定量检测结果 与对照组相比，糖尿病组Runx2 mRNA表达显著下调(P<0.05)；与糖尿病组相比，糖尿病运动组Runx2 mRNA表达显著上调(P<0.01)。与对照组相比，糖尿病组RANK、RANKL mRNA表达显著上调(P<0.05)；与糖尿病组相比，糖尿病运动组RANK mRNA表达显著下调(P<0.05)。见表3。

图1 各组BMSC ALP染色

组别nRunx2RANKRANKL对照组80.126 7±0.058 90.001 6±0.000 70.000 1±0.000 0糖尿病组90.033 6±0.039 31)0.121 1±0.131 62)0.003 1±0.004 21)糖尿病运动组80.180 7±0.092 34)0.001 5±0.000 34)0.000 0±0.000 03)

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与糖尿病组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

3 讨 论

转录因子Runx2是成骨细胞的特异性转录因子，能激活和启动BMSC向成骨细胞系分化，同时调节成骨细胞的分化和功能，对骨组织的形成和骨重建起着至关重要作用〔6〕；RANKL/RANK/骨保护素(OPG)信号通路在成骨细胞及破骨细胞的通讯中起着关键作用，成骨细胞通过改变OPG和RANKL的合成，从而间接调节破骨细胞的分化和成熟。RANK结合RANKL能够促进破骨细胞的分化及成熟。但在这个过程中，OPG作为一种诱饵受体，可以阻断RANK和RANKL结合，骨吸收和骨形成达到平衡的关键就在于RANKL/OPG比值〔7〕。OPG含量低，RANKL/OPG比值高则有利于骨吸收。

本研究表明运动可以降低糖尿病大鼠的体重。糖尿病患者体内胰岛素都存在分泌失调或作用障碍，胰岛素分泌不足可造成骨代谢紊乱，导致骨质疏松，并且胰岛素水平越低，骨代谢异常越明显。胰岛素可直接刺激成骨细胞，促进其细胞内氨基酸蓄积、骨胶原及骨基质的合成分泌。OPG由成骨/基质细胞旁分泌的可溶性因子，在破骨细胞增殖及分化中起关键作用。当胰岛素分泌不足，OPG水平会降低，RANKL/OPG的比值升高将有利于骨吸收〔2，8〕。胰岛素还可通过抑制腺苷酸环化酶(cAMP)合成，减少促进骨吸收〔9〕，抑制高血糖对BMSCs的毒性作用促进骨吸收等〔10〕。运动可提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗〔11〕。原因可能是提高了糖原合成相关酶的活性和数量、改善胰岛素受体后的信号转导过程，上调肌肉葡萄糖转运蛋白等机制来提高胰岛素敏感性〔12〕。但是程守科等〔13〕研究发现，剧烈运动后短时间内胰岛素的敏感性下降，运动中过度氧化是胰岛素敏感下降的重要原因。

同时，肥胖会刺激瘦素分泌，分泌过多则又易导致瘦素抵抗，同时引起脂联素的水平下降。瘦素和脂联素是脂肪细胞中两大重要细胞因子，其参数水平异常则导致骨代谢异常。外周血和组织中瘦素直接作用于相关细胞(譬如BMSCs)刺激骨形成，通过RANKL/RANK/OPG系统抑制骨吸收〔14〕。衣雪洁等〔15〕发现，耐力训练可明显降低体脂和血瘦素水平，上调脂肪的瘦素受体的基因表达，有效地缓解瘦素抵抗，中等强度的运动也可明显增加血液脂联素水平〔16〕。而一次性急性运动对瘦素和脂联素水平改善没有显著作用。

BMSC来源于中胚层——四肢骨骼，是存在于骨髓基质中的一种多能干细胞，属于成体干细胞。连续传代培养和冷冻保存后具有多向分化潜能。在一定的微环境或培养条件下，BMSCs可分化为软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等多种间充质细胞。在体外特定的诱导条件下，BMSCs还可跨越胚层界限，向内胚层和神经外胚层来源的多种组织细胞分化。骨细胞生理的一个重要特点就是破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的新骨形成之间的联系。破骨细胞(骨吸收)是多核细胞来源于肝星状细胞谱系中的巨噬细胞和单核细胞；成骨细胞，骨基质沉淀钙化和脂肪细胞都来源于BMSC，骨髓内脂肪细胞增加可影响成骨细胞的分化和功能，增加破骨细胞活性，影响骨矿化〔17〕。高血糖会抑制BMSC向成骨细胞的分化〔11〕。本次研究与上述的研究一致；表明糖尿病会抑制大鼠BMSC向成骨细胞分化，促进破骨形成。高血糖环境对某些骨代谢信号产生影响，会使Wnt/β-catenin和RANKL/RANK/OPG信号通路失调〔18〕。

细胞能增殖再生意味着有生存能力，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必须为贴壁和有增殖活力的细胞。本文结果表明运动可以改善糖尿病大鼠BMSC向成骨细胞分化的能力；运动可以抑制糖尿病大鼠BMSC向破骨细胞分化的能力。OPG-RANKL-RANK 系统是调节破骨细胞分化和骨吸收功能发挥的一个重要信号通路，还是联系成骨细胞与破骨细胞之间通讯的重要纽带〔19〕。本研究结果表明，运动可能会影响BMSC向成骨细胞分化的潜能，这与先前的研究相一致〔20～22〕。研究报道，运动可以增加小鼠血清雄激素水平，增加抑制破骨细胞形成和骨吸收的细胞因子水平〔23〕。此外，运动过程中应力的刺激通过相关信号通路〔转化生长因子(TGF)-β/骨形态发生蛋白(BMPs)、Wnt〕对BMSC向成骨细胞分化产生影响〔24〕。应力的刺激对BMSC向成骨细胞分化主要体现在运动强度及运动持续的时间上，当运动强度过高、持续时间长时，运动不利于BMSC向成骨细胞分化，其原因可能是造成了细胞机械磨损，从而阻碍了相关的信号通路〔25〕。运动时本身由于需氧量的增加引起氧化应激，释放活性氧(ROS)，低剂量ROS可以促进相关信号通路(MAPK)，使成骨细胞增殖分化，中等剂量则会使其短暂或永久地停止生长，而大剂量则会使其凋亡坏死〔26〕。ROS含量与运动强度、时间密切相关。长时间大强度的运动时，需要更多的氧气，因此ROS含量也会越高。如果ROS不能被及时清除，不利于成骨细胞的分化。此外，急性剧烈运动时，机体抗氧化系统也是不足以平衡氧化系统，从而造成ROS过剩。本文结果证实，中等强度运动是可以改善糖尿病鼠BMSC向成骨细胞的分化能力。