潘理会 霍 峰 李春辉

(承德医学院生物工程研究室，河北 承德 067000)

胃癌的发生、发展因素众多、步骤复杂，并涉及多方面机制。迄今为止，关于胃癌的发病机制尚不清楚。有研究发现胃癌的发生机制可能与间隙连接-43(Cx43)、Hedgehog通路与活化的细胞骨架连接蛋白(P-Ezrin)相关，本实验通过比较Cx43、Shh与P-Ezrin蛋白在正常胃黏膜与胃癌组织中的表达来分析三者与胃癌临床病理特征间的关系及Cx43、Shh与P-Ezrin之间的相互关系。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集承德医学院附属医院2014年3月至2015年10月手术切除经病理证实的胃癌组织标本120例，患者术前均未接受放化疗，正常胃组织(距离肿瘤10 cm以上视为正常胃组织作为对照)50例。120例胃癌患者中，男73例，女47例，年龄29～85〔平均(55.01±10.4)〕岁；>55岁64例，≤55岁56例；高中分化者52例，低分化者68例；无淋巴结转移者50例，有淋巴结转移者70例；未侵及浆膜层者50例，侵及浆膜层者70例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期67例。

1.2主要试剂和仪器 免疫组织化学试剂鼠抗人Cx43、Shh及P-Ezrin 抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Western印迹所用试剂兔抗人一抗Cx43、Shh及P-Ezrin 抗体购自Bioword Technology公司，RIPA组织裂解液(BB120031)购自上海贝博公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗及电化学发光(ECL)超敏发光液均购自北京索莱宝科技有限公司，免疫组织化学所需仪器全自动免疫组化染色机(美国VENTANA，Roche公司)，Western印迹所用仪器紫外分光光度仪(DU800 美国贝克曼公司)，酶标仪MK3(Thermo labsystems公司)。

1.3免疫组织化学法 正常胃组织与胃癌组织常规石蜡包埋，连续切片4 μm贴附于经多聚赖氨酸处理的玻片上，80℃烘烤50 min，将切片放入免疫组织化学染色机按正常程序运行，用磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗(其余染色步骤相同)作为阴性对照，用已知正常胃组织的阳性切片作为阳性对照。光镜下观察切片中Cx43、Shh及Ezrin蛋白的表达和分布情况，每张切片选取5个高倍视野(×400)。Cx43蛋白阳性主要分布于细胞质或胞膜上，呈棕黄色颗粒。Shh蛋白阳性主要分布于细胞质，呈棕褐色颗粒。Ezrin蛋白阳性主要分布于细胞质内呈棕黄色颗粒分布。判断标准同时考虑染色强度和阳性细胞百分率： Cx43、Shh按染色强度分级，无着色为0分，淡黄为1分，黄或深黄2分，褐或棕黄3分；阳性细胞计数<10%为0分，阳性细胞计数10%～25%为1分，阳性细胞计数26%～50%为2分，阳性细胞计数51%～75%为3分，阳性细胞计数≥76%为4分。两者相加<2 分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中等强度阳性()，6～7分为强阳性()。Ezrin蛋白按染色强度分级，无着色为0分，黄或深黄为1 分，棕黄或褐色2 分，深褐色为3分；阳性细胞计数<15%为0分，阳性细胞计数16%～30%为1 分，阳性细胞计数31%～50%为2分，阳性细胞计数51%～70%为3分，阳性细胞计数≥71%为4分。两者相加<2分为阴性(-)，2～3 分为弱阳性(+)，4～5分为中等强度阳性()，6～7 分为强阳性()。结果判定由两名具备高级职称的病理医师经双盲法独立评分。

1.4Western印迹技术 取新鲜组织称量后置于匀浆器内，加入裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)充分匀浆离心后提取组织蛋白。应用BCA法检测蛋白浓度，并计算出蛋白上样体积，加入上样缓冲液后100 ℃水浴10 min。水浴的蛋白依次进行SDS-PAGE电泳(12%分离胶+5%浓缩胶)、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗和显影等步骤。显影后胶片采用Quantity one图像分析软件对蛋白电泳条带灰度值进行定量分析，按照下列公式计算：蛋白相对定量=目的蛋白灰度值/同标本GAPDH内参灰度值。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件行t及秩和检验。

2 结 果

2.1免疫组织化学Cx43、Shh及P-Ezrin在胃癌组织和正常组织中的表达 Cx43、Shh及P-Ezrin阳性表达主要位于细胞质，Cx43正常胃组织中呈强阳性表达，在高-中分化胃癌组织中呈阳性表达，在低分化胃癌组织中呈弱阳性表达；Shh及P-Ezrin在正常胃组织中呈阴性表达，在高-中分化胃癌组织中呈阳性表达，在低分化胃癌组织中呈强阳性表达，见图1。

2.2Western印迹法对胃癌组织和正常组织中的Cx43、Shh及P-Ezrin进行蛋白定量分析 正常胃组织Cx43蛋白的相对含量(0.93±0.09)明显高于胃癌组织Cx43蛋白的相对含量(0.11±0.05)，正常胃组织Shh(0.24±0.02)和P-Ezrin(0.36±0.03)中蛋白的相对含量明显低于胃癌组织(1.17±0.31，2.18±0.54，P<0.05)；Cx43、Shh及P-Ezrin的表达与胃癌的分化程度有无淋巴结转移、胃癌的浸润深度(侵及浆膜层)、TNM分期有关(P<0.05)，与患者的性别和年龄无关(P>0.05)，见图2、表1。

图1 Cx43、Shh及P-Ezrin在胃癌组织和正常组织中的表达(IHC，×200)

临床病理特征nCx43 P值Shh P值P-EzrinP值年龄 >55岁640.27±0.030.4731.23±0.120.4851.74±0.180.187 ≤55岁560.34±0.031.07±0.112.07±0.21性别 男性731.53±0.640.3430.97±0.100.2811.87±0.190.218 女性471.86±0.821.38±0.142.01±0.20分化程度 高-中分化520.41±0.040.0010.7±0.070.0040.90±0.090.000 低分化 680.07±0.011.62±0.163.31±0.32TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期530.43±0.040.0030.74±0.070.0100.85±0.090.007 Ⅲ+Ⅳ期670.06±0.011.67±0.173.47±0.35侵及浆膜 是700.39±0.030.0070.77±0.080.0160.90±0.090.011 否500.07±0.011.58±0.163.33±0.33淋巴结转移 是700.38±0.040.0000.72±0.070.0010.97±0.100.003 否500.07±0.011.66±0.173.29±0.33

1.正常胃组织；2.高-中分化胃癌组织；3.低分化胃癌组织图2 正常胃组织和胃癌组织中Cx43,Shh及P-Ezrin蛋白Western印迹电泳

2.3Cx43与Shh，P-Ezrin蛋白在胃癌中表达的相关性 胃癌中：Cx43与Shh表达呈负相关(r=-0.733，P=0.000)；Cx43与P-Ezrin呈负相关(r=-0.896，P=0.000);Shh与P-Ezrin蛋白呈正相关(r=0.911，P=0.000)。

3 讨 论

Cx43蛋白作为缝隙连接通道的组成部分，在细胞间存在信息交流，发挥细胞间接触抑制的作用，正常细胞及癌旁细胞中均阳性表达。相反，在肿瘤细胞接触抑制的作用常常消失〔1〕，而在癌细胞中最重要的就是细胞间接触抑制消失，导致了Cx43在癌组织中表达明显下降。Li等〔2〕研究结果显示正常胃黏膜中Cx43蛋白的表达量明显比胃癌组织高，而且在正常胃黏膜中完全表达。Tang等〔3〕研究发现胃肿瘤细胞与邻近正常上皮细胞相比，Cx43蛋白呈显著低表达；淋巴结转移阳性的肿瘤细胞与胃原发的肿瘤细胞相比，Cx43蛋白亦呈显著高表达，进而提出Cx43的低表达可能有助于胃癌的发生。本研究结果表明Cx43参与了胃癌转移的过程，所以Cx43有可能成为胃癌预后的一个指标及胃癌治疗的新的作用靶点。

在哺乳动物中，目前已确定了三个Hh家族成员Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)，分别编码为具有自我催化能力的Shh、Ihh和Dhh蛋白〔4〕。目前的研究主要集中于Shh信号通路,它对哺乳动物的神经系统、皮肤、乳腺及胃肠、前列腺等多器官的发育起重要作用。Yao等〔5〕研究证明Shh与皮肤基底细胞癌、小细胞肺癌、前列腺癌、口腔癌等的发生与发展均有密切关系，Alam等〔6〕发现在肺癌细胞系中均存在Shh的高水平表达。本实验认为Shh蛋白是胃癌恶性度高、预后差的预测因子，提供了对胃癌预后的判断，提示Shh是胃癌发生、发展的一个关键作用点，有可能成为胃癌的诊断标志物及一个新的目标靶点。活化的Ezrin(P-Ezrin)有可能介导胃癌的发生、发展，去磷酸化可能是其失活的机制，当磷酸化的Ezrin再去磷酸化后，就可能恢复原来状态，使结合位点失活。Ezrin的失活与激活同样重要，失活得以调控与特异膜表面部位结合的Ezrin数量。磷酸化与去磷酸化保持在平衡状态以维持机体正常的生理功能。肿瘤最主要的死因是它引起的侵袭及转移所表现复杂行为的结果，肿瘤细胞为了能够成功转移必须逃脱许多机体免疫防御机制，因此，越来越多的研究证实，Ezrin在包括胃癌在内的多种肿瘤中存在高表达，且与肿瘤的发生、进展、侵袭、转移密切相关〔7～12〕。Yu等〔13,14〕均报道Ezrin的表达在鼠横纹肌肉瘤和骨肉瘤的转移过程中发挥重要作用，抑制Ezrin蛋白的表达后，两类细胞株的转移能力大大降低，当Ezrin蛋白高度表达后可使原来无转移特性的细胞获得较高的转移能力，显示Ezrin蛋白是肿瘤转移的关键因素，并且是预后差的指标。 本研究结果显示，随着胃癌恶性程度和临床分期的增高，P-Ezrin的表达随之增强，与Yu等〔13,14〕报道结果符合。

Cx43 磷酸化过程能够影响 GJ 的通透性、电导率、门控特性等，从而对细胞间通讯产生各种作用，进而在体内外影响生理或者病理过程。本研究证实，Cx43与Shh和 P-Ezrin呈负反馈调节，Shh与P-Ezrin之间显示正反馈的作用，提示Cx43可调节Hedgehog信号通路，使其在肿瘤细胞中具有调节细胞增殖与分化作用，并且正反馈调节 P-Ezrin基因和蛋白的表达，细胞间黏附减少，运动增加，细胞转化、增殖，促进肿瘤细胞的生长和侵袭能力。