樊晓Chun-Guang LI王平

1浙江理工大学体育教研部（杭州 310018）2 National Institute of Complementary Medicine，Western Sydney University 3杭州师范大学体育与健康学院（杭州 311121）

骨骼肌是机体最主要的运动应答器官，也是物质能量代谢的重要场所。运动可使骨骼肌在形态、结构和功能等方面产生生理性适应和良性重塑，诸如线粒体生物发生、线粒体自噬等线粒体网络结构的重塑[1]。骨骼肌收缩时，其能量需求急剧递增，能量的高效产出和稳定供给是维持骨骼肌代谢稳态的重要保证[2]。骨骼肌线粒体既是细胞的物质代谢中心，也是细胞内信号转导通路的集控中心，对于维持骨骼肌代谢稳态起着重要作用[3]。线粒体大约含有1000多种蛋白质，绝大多数线粒体蛋白由核基因编码，在核糖体形成并转运到线粒体，也有13种参与三羧酸循环的酶类是由线粒DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）编码的[4]。因此，线粒体蛋白质的正确折叠、装配和非折叠蛋白的有效清除和转换，是保证线粒体功能稳定的先决条件[5]。研究表明，先天性线粒体缺陷可导致严重的多系统疾病，线粒体功能异常可引起代谢性疾病、衰老和神经退行性疾病[6]。

正常情况下，线粒体非折叠蛋白的量与折叠蛋白的分子伴侣精确配对，如果分子伴侣不足，线粒体基质会积累大量非折叠蛋白或错误折叠蛋白，这可造成细胞器包括线粒体损伤。最近研究显示，骨骼肌对触发UPRmt的生理、病理性刺激非常敏感，组织缺氧、氧化应激、禁食、合成代谢、钙离子稳态失衡等因素均可诱导UPRmt[7]。病理因素诸如线粒体DNA耗尽、线粒体错误折叠蛋白的积累、线粒体核糖体损伤、线粒体分子伴侣和蛋白酶减少、氧化磷酸化紊乱、葡萄糖高消耗、线粒体源性高活性氧（reactive oxygen species，ROS）、环境温度、毒素等因素也会影响UPRmt[8]。在应激状态下，核基因编码的线粒体分子伴侣热激蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）、热激蛋白 70（heat shock protein 70，HSP70）等均表达上调，帮助已错误折叠的蛋白恢复正常蛋白构象及协助新合成的蛋白发生正确折叠，这个过程称为线粒体非折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein responses，UPRmt）[9]。UPRmt是一种高度保守的适应性应激反应通路[10]，其本质是监测线粒体内的“异自者”（proteostasis），并且激活复杂的线粒体蛋白质量控制网络信号系统，根据微环境变化做出相应的反应，以确保线粒体蛋白组的最佳质量和功能，维持线粒体功能完整[11]，从而维持骨骼肌细胞内代谢稳态。

因此，了解UPRmt对运动性骨骼肌的适应性表型变化的影响，对于揭示运动性骨骼肌新陈代谢稳态的调节机制有重要意义。同时，有效控制该途径可能为防治神经退行性疾病、肌肉功能异常、肥胖和II型糖尿病等代谢疾病发生，以及线粒体等相关疾病的病理机制及防治措施提供新的理论依据[11]。

1 UPRmt的信号调控途径

Zhao等[12]研究了超表达线粒体基质定位的末端错误折叠的鸟苷酸转氨甲酰酶（ornithine transcarbamylase，OTC）后发现，线粒体基质中非折叠蛋白的存在促进了线粒体分子伴侣HSP60、HSP10、mtDnaJ和ClpP（caseinolytic protease）的基因表达，参与蛋白质高级结构的正确折叠，降解体内受到损伤的蛋白质，最终促进线粒体蛋白质的动态平衡，对维持机体代谢平衡具有重要意义。这里值得注意的是，细胞质和内质网的分子伴侣基因表达均未发生变化，提示UPRmt具有特异性。研究证实，HSP60、mtDnaJ和ClpP基因的启动子区均含有线粒体应激反应元件CHOP[transcription factor 4（ATF4）-ATF3-C/EBP homologous protein]，CHOP是C/EBP[CCAAT/enhancer-binding protein（C/EBP）-homologous protein]的同源蛋白[12]。线粒体在氧化应激过程中，CHOP基因表达上调，提示CHOP在UPRmt的信号途径中具有关键作用[12]。另外，内质网应激、细胞毒性、亚砷酸盐等也可激活CHOP[16]。有趣的是，CHOP启动子区含有激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的结合位点，该结合位点对于CHOP在线粒体未折叠蛋白反应中的作用必不可少[13]。而c-Jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）是一种能够激活AP-1的关键上游蛋白激酶，可通过磷酸化c-Jun增强AP-1的转录活性[14]。线粒体非折叠蛋白应激的增加还可促进JNK2磷酸化，为JNK2在CHOP活化过程中的作用提供进一步支持[15]。磷酸化的JNK2与c-Jun结合后激活CHOP，继而诱发线粒体分子伴侣基因，如线粒体UPR元件（mitochondrial UPR elements，MUREs）相关基因的表达[12]。MUREs存在于复杂的线粒体分子伴侣和蛋白酶基因的启动子中，但与MUREs结合的转录因子目前还不是很清楚。同样，其它一些问题，例如细胞如何在线粒体基质中感知非折叠蛋白？在线粒体双层膜结构中信号如何转导？以及CHOP抑制剂减弱线粒体分子伴侣表达的机制等，还需要进一步研究。

研究显示，线粒体膜间腔（the intermembrane space，IMS）也存在独特的UPRmt信号途径[16]。线粒体膜间腔突变核酸内切酶G（endonuclease G，EndoG）的高表达可导致蛋白激酶B（protein kinase B，PKB or AKT）磷酸化和雌激素α（estrogen receptor alpha，ERα）活化，最终引起膜间腔特异的质量控制蛋白酶HtrA2和NRF1（NF-E2-related factor 1）转录因子的表达均显著增加[16]。此外，在应激状态下，线粒体膜间腔蛋白酶体活性增加，提示线粒体膜间腔特异蛋白在输入线粒体之前有泛化素修饰[16]，但其信号通路具体机制尚待探讨。

为了进一步研究UPRmt的分子信号通路，Wrobel等[17]用线虫为模型进行研究发现，转录因子ATFS-1在线粒体应激时参与UPRmt信号调控。ATFS-1包含线粒体靶序列和细胞核定位序列，通常情况下，ATFS-1进入线粒体快速分解，但是在线粒体应激时，ATFS-1的线粒体输入显著下降，导致许多线粒体靶蛋白聚集在细胞质中，绝大多数被蛋白酶识别并降解，以预防错误位置蛋白积累的毒性[18]。但由于ATFS-1还含有一个细胞核定位序列，故其可穿透到细胞核激活UPRmt[19]，但其具体机制还需要进一步研究。

2 UPRmt与线粒体自噬及线粒体蛋白质量控制之间的关系

研究显示，如果线粒体严重受损或死亡会通过自噬途径被清除[20]。线粒体自噬（mitophage）是由PINK1（PTEN induced putative kinase 1）分子诱导发生，其机制是PINK1聚集在去极化的线粒体外膜，募集E3泛素连接酶Parkin（E3 ubiquitin ligase Parkin）启动自噬下游机制，然后和溶酶体融合与降解[21]。而UPRmt是一种翻译应答，是通过增加线粒体特异性分子伴侣和蛋白酶，促进细胞器蛋白动态平衡的恢复[12]。有趣的是，引起线粒体自噬与激活UPRmt的应激源是相同的，譬如损伤线粒体DNA、呼吸链和线粒体核蛋白体基因突变和呼吸链抑制剂百草枯、鱼藤酮等应激源[22]。但其作用途径和时间点有所不同。UPRmt通过上调保护性成分，重塑细胞器蛋白质的动态平衡，最终提高线粒体功能；而线粒体自噬是清除已损伤的或有缺陷的细胞器。UPRmt活化可发生在线粒体自噬途径之前，尽管UPRmt途径已经活化，但是如果细胞器不能维持膜电位，那么损伤的细胞器将会进入线粒体自噬途径，最后如果线粒体损伤太多，细胞将进入凋亡。故关于二者之间途径的交汇及机制还需研究。

线粒体基质中含有特异的分子伴侣HSP60和HSP70[23]，HSP60主要促进相对小的、可溶的、单体蛋白的折叠[24]；而HSP70可执行多种功能，当多肽链穿越线粒体膜时，首先HSP70以一种高能构象结合前导肽链，然后松弛为一种低能构象，使前导肽链进入，并促使后面的肽链解链以进入转运轨道，进入线粒体基质[25]；当多肽链进入基质中时，HSP70作为折叠因子，促进蛋白折叠预防聚集[26]。但到目前为止，还没有在线粒体膜间腔发现有分子伴侣HSP60或HSP70的家族成员[27]。

除了分子伴侣外，线粒体还含有几种控制蛋白酶，包括膜间腔-与多种细胞活性相关的ATP酶（intermembrane space-ATPase Associated with diverse cellular Activities，i-AAA）和 基质（腔）-与多种细胞活性相关的ATP酶（matrix-ATPase Associated with diverse cel-lular Activities，m-AAA），这些酶的作用是识别、降解不能正确折叠或聚集的蛋白质，对于维持机体的正常代谢和适应各种应激反应起着重要作用[28]。此外，UPRmt还包含许多抗氧化基因，如线粒体超氧化物歧化酶和谷胱甘肽，这些抗氧化物可以预防线粒体源ROS引起的蛋白质和细胞膜的损伤[19]。蛋白翻译水平的增加和抗氧化酶活性的增强不仅促进了细胞器功能，同时也为可挽救的细胞器的恢复或再生提供了条件，稳固了蛋白折叠的内在环境，而不可修复的细胞器通过线粒体自噬进行降解[29]。

3 UPRmt与骨骼肌代谢

骨骼肌不仅是机体最大的蛋白质储存库，也是能量需求的重要器官，尤其在肌肉收缩或运动时，能量需求急剧增加，所需能量主要来自于线粒体的氧化代谢[2]。线粒体是生物氧化和能量交换的主要场所，不仅进行三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OxPhos）产生ATP，为生命活动提供能量和生物合成底物，而且在氨基酸、脂质和核苷酸的物质代谢过程中也起着重要作用[30]。氧化磷酸化是释放代谢能的主要环节，此过程涉及mtDNA编码的一些线粒体蛋白质如电子传递链酶复合体中的亚基，包括电子传递链复合体I～IV，分别是NADH-CoQ氧化还原酶、琥珀酸-CoQ氧化还原酶、CoQH2C-细胞色素C氧化还原酶、细胞色素C氧化酶和ATP合酶复合体；同时，mtDNA还可以编码线粒体的tRNA、rRNA，这些RNA对蛋白质的合成至关重要[31]。最近研究显示，UPRmt涉及多种细胞代谢途径包括糖酵解和氨基酸分解代谢[32]。UPRmt可抑制三羧酸循环和氧化磷酸化转录物的积累，调控相关基因转录和翻译匹配，以确保电子传递链复合物的高效合成、装配和生物发生，同时通过增加糖酵解相关基因的表达维持ATP的增长，减轻线粒体应激或改善新陈代谢状态以促进细胞生存[32]。

研究显示，UPRmt活性增加可恢复或延长骨骼肌线粒体的功能和延长寿命[33]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是线粒体氧化还原过程中的必需辅酶，在TCA、OxPhos过程中起核心枢纽作用，其主要作用是可逆接受电子和H离子，保持线粒体膜电位，保证ATP的产生。研究显示，衰老小鼠骨骼肌[34]和高脂高糖膳食小鼠肝脏[15]NAD含量显著下降，而通过基因方法或药学方法可明显增加NAD水平，明显改善线粒体功能，甚至延长寿命[15]。其作用机制可能是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+），激活去乙酰化酶（sirtuin，SIRT），介导转录因子 PGC-1α和FOXO3所致。同时，NAD水平增加可激活UPRmt。

综上所述，UPRmt的活化可以精准协调OxPhos和TCA的基因表达和匹配蛋白折叠，以恢复线粒体功能，同时可增加线粒体蛋白质内稳态的能力。有趣的是，UPRmt可通过限制TCA活性而使NAD/NADH保持高水平状态一直保持到线粒体活性的恢复，此时，TCA循环的相关基因转录可开始表达[35]。

4 UPRmt与骨骼肌运动适应

骨骼肌不仅是机体的运动器官，也是细胞能量代谢的重要场所。骨骼肌运动收缩时，其能量需求急剧增加，因此，骨骼肌线粒体能量的高效产出和稳定供给是维持骨骼肌代谢稳态的重要保证[2]。研究表明，线粒体直接应答运动引起的氧耗、ATP需求的增加，发生适应自身结构与功能的表型变化，同时自身也产生一部分蛋白质，对细胞、组织、器官乃至机体的运动适应表型改变都发挥着调控作用[3]，但其潜在的分子机制尚不清楚。

研究发现，运动性骨骼肌线粒体发生表型改变与UPRmt密切相关[36]。Memme等[11]对大鼠胫骨前肌（tibialis anterior，TA）和趾长伸肌（extensor digitorum longus，EDL）分别进行1、2、3、5、7天的电刺激（频率10赫兹，电压6伏，脉冲0.1毫秒，每分钟间歇999毫秒，每天刺激3小时）模拟耐力运动（持续7天刺激相当于6周耐力运动），结果发现，UPRmt相关蛋白ClpP的mRNA表达均显著增加，尤其是运动第2天，增加了70%，第5天和第7天均增加了45%，此蛋白对未折叠的基质蛋白能感知并做出相应反应。同时，线粒体调控蛋白Sirtuin 3的蛋白表达于2～7天均显著增加，线粒体分子伴侣 CPN10（mitochondrial chaperones 10-kDa chaperonin）、HSP60和HSP70的mRNA表达均显著增加，HSP60和CPN10的蛋白表达也显著增加，线粒体转录因子CHOP的mRNA和蛋白表达于1～7天均显著增加，这些结果均提示UPRmt对机械刺激非常敏感，并且对机械刺激保持一个适应状态。因此，UPRmt可能在运动性骨骼肌线粒体适应重塑过程中具有积极作用。另外，也有研究发现，骨骼肌细胞的运动负荷过度时，线粒体内的蛋白质可能发生错误折叠，此时，UPRmt被激活，通过一系列应激保护机制提高线粒体功能，保护细胞维持动态平衡，以维持骨骼肌代谢稳态[9]。但也有相反的报道，Kim等[37]对大鼠分别进行中等强度运动（坡度10°运动速度20 m/min，每次持续时间 60 min，共5周）和大强度运动（坡度10°，运动速度34 m/min，每次持续时间 60 min，共5周），结果发现两运动组大鼠腓肠肌UPRmt相关蛋白CHOP mRNA水平均显著下降，其中大强度运动组比中等强度运动组下降得更明显，其具体机制还需要进一步研究。

5 小结与展望

综上所述，UPRmt是一种应激反应信号途径，在线粒体基质积累或产生大量未折叠或错误折叠的蛋白质时激活，上调控制核基因编码的线粒体分子伴侣蛋白HSP60、HSP70等基因的表达，帮助发生错误折叠的蛋白恢复正常蛋白构象及协助新合成的蛋白发生正确折叠，将信号从线粒体转导至细胞核，此过程有助于维持线粒体内蛋白质的动态平衡和细胞存活。到目前为止，UPRmt介导的保护作用主要体现在代谢调节，因此，UPRmt有可能是有效防治胰岛素抵抗、肥胖和II型糖尿病等代谢疾病发生的靶点之一。运动通过增强UPRmt信号通路进一步巩固和优化线粒体功能，维持骨骼肌质量和功能完整性，从而稳定骨骼肌代谢功能的稳态。

临床和动物实验研究均已证实运动能够激活UPRmt通路，从而调节线粒体分子伴侣、线粒体自噬和OxPhos及TCA相关基因的表达，稳定线粒体蛋白质代谢和能量代谢平衡，维持骨骼肌代谢稳态。因此，URP-mt可能是运动性骨骼肌代谢稳态的重要介导因子之一（图1）。

图1 UPRmt介导的运动性骨骼肌代谢稳态示意图

但目前有关运动性UPRmt调节骨骼肌代谢稳态的分子信号机制还存在一些亟待研究和探讨的问题：（1）线虫UPRmt的调控主要依靠转录因子ATFS-1，但哺乳动物是否也依赖ATFS-1途径还不清楚。（2）长期规律性运动可否使UPRmt和线粒体自噬更好地适应骨骼肌代谢和线粒体蛋白质量控制机制；（3）对UPRmt调控CHOP mRNA的相反报道有待深入探讨其原因；（4）UPRmt信号调控是通过线粒体的蛋白输入效率还是通过一种自主选择方式进行；UPRmt信号激活后，非折叠蛋白如何识别信号分子等问题也需进一步探讨。

研究发现[38]，酵母转录因子ATFS-1包含一个线粒体靶序列（a mitochondrial targeting sequence，MTS）和一个核定位序列（a nuclear localization sequence，NLS），当氧气和血红素少的时候，其被激活，促进血红素形成。因为许多哺乳动物转录因子中含有MTS，并且位于线粒体中，我们可以推测其可能有相似的调控方式。也许ClpP可充当应激感受器，对主要蛋白折叠缺陷提出“异议”，从而“识别”线粒体是变更还是重组，上述情况在运动应激状态下是否还成立，尚需进一步研究。深入探析和解决这些问题，将会进一步揭示运动介导的UPRmt在调节骨骼肌代谢稳态中的重要作用。