陈光侯，熊胜利，李 平，陈大芳，谢玲玲，任丽群，李 波，王 钦，龙清孟，冉雪琴

（1.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州 贵阳 550018；2.贵州大学，贵州 贵阳 550025）

断奶前后仔猪腹泻是生猪养殖产业中的一种常见疾病，而且死亡率很高，直接影响养猪生产的经济效益。据报道，在养猪业发达国家，如瑞典、英国和丹麦，新生仔猪腹泻病的发生率分别为75.0%、50.5%和36.6%[1-3]。我国仔猪腹泻病的发生率也很高，2012年对国内某省4 118个养猪场户进行流行病学调查发现，哺乳仔猪腹泻发生率高达18.31%、死亡率在10.44%~57.01%之间不等[4-5]。早年在猪流行性腹泻病毒还没大量报道之前，我国仔猪腹泻病的发生率全年平均高达46.5%[6]，个别地区甚至更高。近年来更是出现猪流行性腹泻病毒和肠毒素大肠杆菌（ETEC）混合感染导致仔猪大面积腹泻发生和死亡的事件。研究表明，产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli F4,ETEC F4）是引发断奶前后仔猪腹泻病的最主要致病菌[7-8]。F4为大肠杆菌ETEC的菌毛类型之一，分为F4ab、F4ac及F4ad，其中分布最广泛的主要血清型是F4ac[9]。研究表明ETEC的F4ab、F4ac候选受体为MUC13（跨膜黏蛋白），主要是在胃肠道上皮表面[10-11]。

多年来，贵州省种畜禽种质测定中心一直致力于开展国外引进种猪选种选育研究，尤其是抗性新品系的培育工作及推广应用研究。种猪场在世代选育中采用了抗腹泻基因检测技术，保留腹泻抗性有利基因GG型个体，组建核心群种猪抗腹泻新品系，建立大约克种猪抗腹泻选育示范点。基础猪群采耳样组织，送往江西农业大学进行抗腹泻基因检测研究，结果表明大约克种猪在MUC13基因腹泻抗性等位基因GG的频率为16.79%（23/137），G基因频率为0.46，腹泻易感不利等位基因A基因频率为0.54[12-13]，这一检测结果表明，利用分子育种技术辅助育种，兼顾选留表型和生产性能优秀个体，逐世代加大GG纯合抗性个体的选留比例，逐步淘汰AA和GA易感基因型个体，可使得育种群中有利基因频率提高，最终建立抗K88（F4ac）腹泻专门化品系。中心开展了大约克种6个不同基因型的组合配种方案：GG♂×GG♀、GG♂×GA♀、GA♂×GA♀、AA♂×GG♀、AA♂×GA♀、AA♂×AA♀，在相同的饲养环境条件下，跟踪观察其哺乳仔猪腹泻发生率、腹泻致死率、其他原因致死率、断奶成活率，结果表明不同组合选配所生仔猪在哺乳期间的腹泻发生率相应为 2.71%、26.44%、46.18%、30.32%、40.96%、44.14%；不同组合选配其后代腹泻致死率相应为 0、3.07%、6.49%、3.94%、11.65%、12.5%；不同组合选配其哺乳仔猪其他原因致死率相应为0.78%、1.92%、2.67%、1.97%、4.42%、5.08%；其断奶成活率分别为 99.22%、95.02%、90.84%、94.09%、83.94%、82.42%[13]。由此可见，利用分子技术辅助选育进行ETEC F4ac腹泻抗性有利基因GG型个体选育，组建种猪抗腹泻基础群（新品系），可以从种源上提高种猪质量，从而最大限度控制规模化猪场新生仔猪及断奶前后仔猪腹泻的发生率，挖掘断奶仔猪提高成活率的潜力，对提高猪场的经济效率和国外引进种猪的使用价值具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品

贵州省种畜禽种质测定中心课题组人员在科研试验场挑选46头大约克种猪为研究群体，于2017年6月13日采耳样组织，进行腹泻基因检测，明确基因型。2017年7月中旬，将大约克种猪按照3个不同组合（GA♂×GG♀、GG♂×GG♀、GA♂×GA♀）进行选配，对不同组合生下的后代进行后备种猪初选。2018年1月18日对仔猪进行耳组织采样，每头猪采1份耳组织，开展抗腹泻基因的个体选育研究。耳组织2~3 g，于75%乙醇的离心管中-20℃低温保存，采用天根生化科技（北京）有限公司生产的血液基因组DNA，提取试剂盒制备基因组DNA，作为PCR检测的模板。

1.2 主要验仪器设备

①离心机（Avanti-J30I），美国贝克曼库尔特公司生产；②制冰机（banshen），美国Grant公司生产；③凝胶成像系统（Gel Doc XR），美国Bio-rad公司生产；④荧光定量PCR仪（MyCycler），美国Bio-rad公司生产；⑤标准型净化工作台（SW-CJ-IFD），上海锦星科学仪器有限公司生产；⑥电泳仪（DYY.III2稳压电泳仪），北京六一仪器厂生产；⑦-80℃超低温冰箱，美国Thermo公司生产；⑧水浴恒温锅（SHZ-82），中国金坛市医疗仪器厂生产。

1.3 PCR扩增

根据GenBank上公布的猪MUC13基因序列设计4条特异性的引物（表1），由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

表1 引物序列

PCR 反应体系为 10 μL：2×PCR mix 5.0 μL，引物（10 pmol/L）各 0.5 μL，基因组 DNA（100 ng/μL）1.0 μL，双蒸水补足 10 μL 体积。扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃/63℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30个循环；72℃延伸 10 min，4℃保存。扩增产物经以2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 基因型检测结果

将电泳得到173 bp条带定为A基因，83 bp条带定为G基因，如只得到1条173 bp条带的样品定义为AA基因型，只得到1条83 bp条带的样品定义为GG基因型，如得到2个条带即为杂合的AG基因型（图1）。

图1 GG基因型（左）和AA基因型（右）

2.2 克隆测序

将得到的173 bp和83 bp两种条带分别切胶回收，连接T-载体，送上海英潍捷基贸易有限公司进行基因克隆测序，证实扩增片段确为MUC13基因，位于内含子7当中，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，依据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型为G或A。

2.3 基因型频率和基因频率

试验从猪场的基础繁殖群中挑选46头大约克种猪为研究对象，开展基因检测，明确其腹泻相关基因型，结果见表2。

从表2可以看出，本次检测的基础群46头大约克（40头母、6头公），检出抗腹泻基因型GG个体12头（2头公猪，10头母猪），腹泻易感基因型GA个体为34头（30头母猪、4头公猪），腹泻易感基因AA型个体为0，其基因型频率与基因频率见表3。

表2 基础繁育群抽检的46头大约克（母猪40头、公猪6头）抗腹泻基因型

表3 46头大约克猪的基因型频率及基因频率

试验将已明确基因型的母猪与公猪，采用3种不同基因型进行组合选配：①GA♂×GG♀组合方式配 3产（即分别对应 1、2、3窝）；②GA♂×GA♀组合方式配 3产（分别对应 4、5、6窝）；③GG♂×GG♀组合方式配2产（分别对应7、8窝）。保育期结束（仔猪满双月龄）时，根据猪场猪群血统、系谱实际情况，确定预留后备猪仔猪。预留仔猪查看分娩记录，包括窝产仔数、初生重、断奶重，观察仔猪乳头对数是否达到7对、要求乳头对称、无发育不良的奶头，公猪睾丸发育是否良好、睾丸是否对称，仔猪体重及体型外貌表现是否优秀等情况，初步预留后备猪。本研究是在传统选育的基础上，对初步预留的后备仔猪，采耳组织样，开展抗腹泻基因检测，目的是选留腹泻抗性有利基因型GG个体作为后备猪，最终组建抗腹泻新品系。本次对8产（8窝）选留的60头预留后备猪仔开展抗腹泻基因型检测，结果见表4。

表4 大约克种猪不同配种方案后代抗腹泻基因检测结果与分析

续表4 大约克种猪不同配种方案后代抗腹泻基因检测结果与分析

本研究按照GG♂×GG♀组合选配2窝，其后代预选留（随机挑选）的16头仔猪，进行抗腹泻基因检测，结果均为抗腹泻有利基因GG型个体，有利基因型检出率100%，说明大约克种猪按照GG♂×GG♀组合选配，所生的仔猪均为抗腹泻GG个体。这一结果与熊胜利等、龙清孟等对杜洛克猪群、加系大约克猪群的抗腹泻基因研究基本一致[14-15]。

从表4可知，预留的60头大约克后备猪仔猪，抗腹泻基因GG型个体24头（12头母猪、12头公猪），腹泻易感基因GA型个体31头（20头母、11头公），腹泻易感基因AA型个体5头（3头母猪、2头公猪），其基因型频率、基因频率见表5。

表5 选留的60头大约克后备猪抗腹泻基因的基因型频率和基因频率

3 讨论

3.1 建立大约克种猪抗腹泻新品系选育思路

抗性育种是种猪育种发展的重要方向，优质抗病种猪新品种（系）的培育是一项复杂的系统工程，传统的常规选育技术难以获得有效的遗传进展。参考前人的研究结果，结合抗腹泻基因检测辅助选育，总结分析一个猪场要开展腹泻抗性新品系选育时，首先最好把该猪场的核心群、基础繁育群的公母全部采样，进行抗腹泻基因检测，明确核心群种猪、基础繁育群不同个体的基因型。

3.2 组建抗腹泻种猪基础群（包括种公猪及种母猪）

根据抗腹泻基因检测结果，可组建核心群种猪（原种猪群）腹泻抗性基因GG型群体，或抗腹泻基因GG型基础繁育群。

3.3 根据系谱，开展不同组合基因型公母选配

（1）最佳组合选配方案为GG♂×GG♀。选用该组合选配方式，其所生的后代均为腹泻抗性GG型个体，直接根据血统需要选留体型外貌、生产性能等优秀的个体作为后备种猪进行扩繁，最终建立大约克抗腹泻新品系，这是最直接最理想的选育方案。

（2）其次考虑 GA♂×GG♀、GG♂×GA♀两种组合选配，其后代在选留后备猪时，采样进行抗腹泻基因检测，最终选留腹泻抗性GG型个体。

本研究根据生产需要，把生产性能、体型外貌都表现优秀的腹泻易感基因GA型先保留下来，按照GA♂×GG♀，进行组合选配，从其F1代中选出符合种用的预留后备种猪21头，并采耳组织样进行抗腹泻基因检测，检出GG型个体8头，GG型个体检出率 38.1%（8/21）。

按照GA♂×GA♀组合选配，从F1代中选留符合种用的预留后备仔猪23头，进行抗腹泻基因检测，结果抗腹泻有利基因型个体GG检出率为0，说明按照该组合选配，其所生的后代抗腹泻基因GG型个体检出率低。

因为本研究不是采用整窝仔猪都检测，而是只针对符合后备种猪预留条件的仔猪进行抗腹泻基因检测，只能说明GA♂×GG♀组合其后代GG型个体的检出率高于GA♂×GA♀组合选配的。要深入了解GA♂×GG♀与GA♂×GA♀组合选配其所生仔猪的有关腹泻基因型分配情况，这有待于进一步深入研究，需要整窝仔猪采样检测，并且扩大检测窝数。

（3）最后考虑按照GG♂×AA♀、AA♂×GG♀方案进行组合选配。

在实际生产中，尤其在纯种繁育场，必须充分考虑血统、系谱、繁殖性能、兼顾体形外貌等指标，因此，保全种猪场血统、系谱需要的前提下，必须尽可能保留繁殖性能较为优秀的GA、AA基因型个体，再按照GG♂×AA♀、AA♂×GG♀方案进行组合选配，对符合后备种猪选用条件的F1代、F2代、甚至F3代进行抗腹泻基因检测，最终选留其抗腹泻后代，再逐步淘汰腹泻易感型基因GA型、AA型的父母本。可见选育多个血统纯种大约克抗腹泻新品系所需的时间更长。

3.4 种猪腹泻抗性新品系建立后导入新的血缘，扩大抗腹泻基因型个体的最佳组合选配面

在纯种繁育场保全血统、系谱完整、已建立健全抗性新品系基础群的前提下，通过引种导入新血缘，避免重蹈闭锁选育的覆辙。

首先将新引进的新血缘个体，进行抗腹泻基因检测，明确引进群体的基因型情况。其次再根据优先组合选配原则，最先考虑GG♂×GG♀组合选配方案，其次考虑GA♂×GG♀、GG♂×GA♀两种组合选配。

3.5 杂交利用

抗性新品系核心群组建后，开展不同品种间的杂交利用，一方面提高了抗腹泻种猪的利用价值，另一方面可以提高杂交后代的抗腹泻能力，减少仔猪腹泻死亡率，从而提高了猪场的经济效益。