王 静，徐俊南，常婷婷，樊明涛*

（西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

我国是目前世界上最大的猕猴桃生产国，每年产量约106万t，占全球总产量的38%[1]。猕猴桃营养丰富并具有高抗氧化活性，其高抗氧化活性与果实中的多酚、VC、多糖等活性物质密切相关。PARK Y S等[2]研究发现多酚类对猕猴桃的抗氧化活性影响最大，VC次之，多糖最小。但猕猴桃属于呼吸跃变型水果，容易腐败变质，每年都有大量的果实浪费。在产地将猕猴桃发酵成果酒，既避免了浪费又增加了产业的产值[3]。

猕猴桃酒是指用新鲜猕猴桃经酵母发酵得到的果酒。猕猴桃酒不仅色泽清亮，味甘醇和，而且保留了果实中大量的营养物质。其中多酚类物质具有抗氧化[4]、降血压、降血脂等保健功能。VC是最重要的亲水性抗氧化剂[5]，能有效清除超氧阴离子自由基、羟基自由基和单线态氧等，并且可以被人体直接吸收利用。单宁也具有抗血栓形成、抗癌[6]、抗炎[7]和抗病毒等性能[8-9]。同时，这些营养物质与酒体的感官品质有关，水果中的多酚类物质对酒体颜色、口感有明显的影响[10]，单宁能沉淀蛋白质、稳定色素、改善酒体涩味，提高圆润感[11-12]。

皮渣包括果皮、果渣和种子。猕猴桃皮渣含有大量的多酚、黄酮及多糖等物质[13]。YULIARTI O等[14]研究发现，猕猴桃皮渣的质量约是整个果实的40%～50%，猕猴桃皮渣与猕猴桃果实相比，蛋白含量相近，但中性多糖的含量是其2倍以上。焦岩等[15]研究发现猕猴桃皮黄酮提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长均有很好的抑制效果。目前关于猕猴桃酒清汁发酵与带渣发酵的对比研究较少，因此，本试验主要研究猕猴桃酒主发酵过程中多酚、VC和单宁含量的变化，以及带渣发酵对猕猴桃酒品质的影响，从而增加对猕猴桃酒潜在健康益处的了解，为猕猴桃酒产业的发展奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所用猕猴桃（海沃德、秦美、红阳3个品种）：购于陕西省杨凌农贸市场；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WLP775：保存于西北农林科技大学食品微生物与生物技术实验室；1,1-二苯-1-苦基苯肼自由基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH）、2,2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（2,2'-azinobis（3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic acid）diammonium salt，ABTS）、儿茶素和没食子酸：美国Sigma公司；果胶酶（40 U/mg）：北京索莱宝科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：国药集团化学试剂有限公司；福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂：上海荔达生物科技有限公司；甲基纤维素（40 000 mPa·s）：上海麦克林生化科技有限公司；抗坏血酸、氢氧化钠、碳酸钠及过硫酸钾等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

榨汁机：南通金橙机械有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV-1240紫外分光光度计：日本岛津公司；pH计：上海精密科学仪器有限公司；手持糖度仪：福建泉州光学仪器厂；HH-S4A型电热恒温水浴锅、DH-420A电热恒温培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；HS-840型水平层流单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猕猴桃酒的酿造

本试验采用海沃德、秦美和红阳3种猕猴桃为原料，分别采用清汁和带渣发酵，酿造6种猕猴桃酒，分别为海沃德清汁发酵酒（HWD-Q）、海沃德带渣发酵酒（HWD-Z）、秦美清汁发酵酒（QM-Q）、秦美带渣发酵酒（QM-Z）、红阳清汁发酵酒（HY-Q）、红阳带渣发酵酒（HY-Z），具体酿造工艺如下：

挑选新鲜成熟猕猴桃分别榨汁和打浆，装入发酵罐，同时添加60 mg/L SO2和50 mg/L果胶酶，常温下酶解24 h，按4%的接种量接入事先活化好的酿酒酵母，常温下发酵10 d，每天测定可溶性固形物，隔天留样。当可溶性固形物基本保持不变时，倒罐并加入60 mg/L SO2，结束酒精发酵。

1.3.2 猕猴桃酒基本理化指标的测定

酒精度的测定参照GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》；可滴定酸（以苹果酸计）、pH值及可溶性固形物的测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；还原糖（以葡萄糖计）的测定采用DNS比色法[16]。

1.3.3 总多酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu法[17]进行测定，结果以没食子酸计。

1.3.4 VC含量的测定

采用2,6-二氯靛酚滴定法，具体参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.5 单宁含量的测定

参照SARNECKIS C J等[18]的方法并改进。在10 mL离心管中加入0.5 mL适当稀释的样品，加入3 mL 0.04%甲基纤维素溶液上下翻转数次后静置2 min（对照组不加甲基纤维素溶液），加入2 mL饱和硫酸铵溶液，用去离子水定容到10 mL。室温条件下反应10 min后，于6 000 r/min条件下离心5 min弃沉淀，波长280 nm处测定吸光度值，样品中单宁的吸光度值为对照组吸光度值减去样品组的吸光度值，结果以儿茶素表示。

1.3.6 猕猴桃酒体外抗氧化能力的测定

还原能力参照WU Q等[19]的方法，反应液吸光值越大表明样品还原能力越强；DPPH自由基清除率参照CUMBY N等[20]的方法；ABTS+·清除率参照PARK Y S等[21]的方法。

1.3.7 数据分析

采用Microsoft Office Excel绘图；SPSS20.0进行显著性和相关性分析。所有样品均平行测定3次，测定结果以表示。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃酒基本理化指标

发酵完成后6种不同猕猴桃酒的基本理化指标见表1。由表1可知，6种猕猴桃酒的可溶性固形物含量在6.00%～6.90%，还原糖在4.67～7.08g/L，酒精度在4.83%vol～6.00%vol，基本属于低度干型果酒。清汁酒的可溶性固形物含量、还原糖含量较带渣酒低，这可能是因为皮渣中有更多的糖类浸渍到发酵体系中。pH值为3.23～4.19，可滴定酸为9.39～19.72 g/L，和其他果酒基本相似。海沃德与秦美清汁酒的可滴定酸较带渣酒的高，红阳酒与之相反，这可能与猕猴桃品种有关[22-23]，且清汁酒发酵过程中酵母菌代谢更旺盛，积累了更多的有机酸。过高的酸度对酒的口感、柔和度都有一定的影响，所以对发酵结束后的猕猴桃酒进行降酸处理，有助于提高果酒的品质[24]。

表1 六种不同猕猴桃酒的基本理化指标Table 1 Physicochemical indexes of six kinds of kiwi wines

2.2 猕猴桃酒发酵过程中可溶性固形物的变化

猕猴桃酒发酵过程中可溶性固形物含量的变化见图1。由图1可知，发酵前3 d，可溶性固形物含量基本保持不变，发酵第3～7天，可溶性固形物含量快速降低，第7天以后基本保持不变，且带渣发酵酒的可溶性固形物降速高于对应的清汁发酵酒，这说明带渣发酵能提高发酵速率。酒精发酵初始阶段，酵母菌适应环境并增殖，消耗糖类较少，可溶性固形物下降较慢，当酵母增殖到较大细胞量时，消耗糖量的速度大大加快，固形物含量快速下降至较低浓度。发酵后期，体系中基本不含酵母菌可利用的糖，可溶性固形物含量基本保持不变。此时对酒进行皮渣分离，结束酒精发酵。

图1 猕猴桃酒发酵过程中可溶性固形物含量的变化Fig.1 Changes of soluble solids contents during kiwi wine fermentation

2.3 猕猴桃酒发酵过程中总多酚含量的变化

猕猴桃酒发酵过程中总多酚含量的变化见图2。由图2可知，6种猕猴桃酒总多酚含量随发酵时间的延长变化不同。海沃德和红阳酒的总多酚含量维持在0.8 g/L左右，秦美酒的总多酚含量则经历了先降低后升高最后又降低的过程。这种差异可能与不同品种猕猴桃中总多酚的初始含量有关。酒精发酵过程中总多酚含量的变化主要与发酵体系、多酚类物质的浸提以及多酚参与的生化反应等有关[25]。在发酵过程中，酵母菌繁殖不断的产生乙醇和二氧化碳，有利于多酚类物质的浸提，另一方面，多酚易氧化分解且能以疏水键、多重氢键与蛋白质、核酸、细胞膜等生物大分子相结合，黄惠华等[26]研究发现由于酒精发酵产热，体系乙醇浓度不断增加，与蛋白质络合态的多酚量不断增加，导致试验检测到的总多酚含量减少。另外，发酵过程中除个别点外，带渣发酵酒的总多酚含量均高于对应的清汁发酵酒。

图2 猕猴桃酒发酵过程中总多酚含量的变化Fig.2 Changes of total polyphenols contents during kiwi wine fermentation

2.4 猕猴桃酒发酵过程中VC含量的变化

图3 猕猴桃酒发酵过程中VC含量的变化Fig.3 Changes of VC contents during kiwi wine fermentation

猕猴桃酒发酵过程中VC含量的变化见图3，由图3可知，不同品种和发酵方法得到的猕猴桃酒VC含量变化不同。海沃德和红阳清汁酒的VC含量在发酵初期不断升高，后期不断降低，而其他4种酒的VC含量在发酵前两天降低，之后升高，6 d之后再次降低。这可能是由于在发酵前期，清汁发酵有利于VC的浸提，海沃德和红阳清汁酒的VC含量有所升高。VC是一种较不稳定的水溶性维生素，在发酵体系中可通过氧化和非氧化反应降解[27-28]，且带渣发酵不利于VC的浸提，所以带渣酒的VC含量降低。随着发酵的进行，发酵液的低含氧量、低pH（3.68～4.06）以及大量的类黄酮类物质都有利于保持VC的稳定性，含量有所上升。发酵后期，光和热导致VC不断氧化分解，含量降低。

2.5 猕猴桃酒发酵过程单宁含量的变化

图4 猕猴桃酒发酵过程中单宁含量的变化Fig.4 Changes of tannin contents during kiwi wine fermentation

猕猴桃酒发酵过程中单宁含量的变化见图4。由图4可知，猕猴桃酒发酵过程中海沃德和秦美带渣酒的单宁含量分别在发酵前4 d和前2 d升高，之后快速降低，其余4种酒的单宁含量在发酵前6 d持续降低，最后都维持在一个较低水平。酒中的单宁含量与酿造过程中单宁的浸提密切相关，发酵前的低温浸渍有利于单宁的浸提，所以发酵初期，带渣酒的单宁含量较清汁酒高[29]。发酵过程中单宁含量的降低可能是单宁的氧化、沉淀或者缩合反应引起的，该试验结果与ZHANG Y等[25]研究葡萄酒发酵过程中单宁含量变化结果相一致。

2.6 带渣浸渍对猕猴桃成品酒多酚、单宁及VC含量的影响

不同品种猕猴桃酒（发酵10 d）总多酚、单宁以及VC含量的比较结果见图5。由图5可知，清汁酒与带渣酒的总多酚、单宁及VC含量均存在显著性差异（P＜0.05），带渣发酵能显著提高酒中的总多酚和单宁含量，这与ÁIVAREZ I等[12，30-31]研究结果一致。水果皮渣含有大量的酚酸、黄酮及多糖等活性物质[32]，发酵过程中，由于酵母活动和浸渍作用，皮渣中的营养成分逐渐溶解到发酵液中，能有效的提高这些物质在酒中的含量。猕猴桃鲜果的VC含量为100～400 mg/100 g[33]，不同的猕猴桃品种VC含量差异较大，由图5C可知，带渣酒的VC含量显著低于清汁酒（P＜0.05），这可能与VC的性质和酒发酵结束后的皮渣分离有关。

图5 不同种猕猴桃酒总多酚（A）、单宁（B）及VC（C）含量的比较Fig.5 Comparison of contents of total polyphenols(A),tannin(B)and VC(C)contents in six kinds of kiwi wines

2.7 带渣浸渍对猕猴桃成品酒抗氧化活性的影响

由图6可知，6种猕猴桃酒还原力的吸光度值为0.17～0.46，DPPH清除率为60.81%～95.04%，ABTS+·清除率为5.35%～20.26%。带渣酒的还原力均显著大于清汁酒（P＜0.05），这与猕猴桃酒中总多酚含量结果一致。DPPH、ABTS+·清除率根据不同的猕猴桃品种和发酵方法表现出不同的结果，这可能由于不同的猕猴桃酒中总多酚和VC等抗氧化物的含量不同，不同自由基清除反应的机理不同。2.8猕猴桃酒活性物质含量与抗氧化活性相关分析

图6 不同种猕猴桃酒抗氧化活性的比较Fig.6 Comparison of antioxidant activities of different kiwi wines

猕猴桃酒活性物质含量与抗氧化活性相关分析结果见表2。由表2可知，猕猴桃酒总多酚含量和酒体还原力呈极显著正相关（P＜0.01），与DPPH清除率呈显著正相关（P＜0.05）。VC含量与还原力、DPPH及ABTS+·呈显著正相关（P＜0.05）。这表明猕猴桃酒的抗氧化活性与酒体中的多酚和VC有关，多酚类物质结构中均含有活性羟基，能够提供电子，表现出还原力和清除自由基的能力，VC在C3、C4含有烯二醇结构，这是VC具有抗氧化活性的主要原因[26]。单宁含量对酒体抗氧化活性影响不大，这可能由于单宁在猕猴桃酒中的含量较少。

表2 猕猴桃酒活性物质含量与抗氧化活性相关分析Table 2 Correlation between active substance contents and antioxidant activities of kiwi wines

3 结论

猕猴桃品种及发酵方法对猕猴桃酒发酵过程中总多酚、VC及单宁含量的变化以及在猕猴桃成品酒中的含量、成品酒的抗氧化活性都有一定的影响。

其中，猕猴桃品种对总多酚含量的变化影响较大，海沃德和红阳品种酒的多酚含量基本保持不变，秦美酒则经历了先降低后升高最后又降低的过程。发酵方法对VC、单宁含量的变化影响较大，除秦美清汁酒外，海沃德和红阳清汁酒的VC含量先升高后降低，而3种带渣酒的VC含量先降低再升高，最后再降低，3种清汁酒的单宁含量不断降低，最后维持在一个较低水平，而海沃德和秦美带渣酒的单宁含量先升高再降低，最后基本保持不变。另外，带渣发酵能提高酒体总多酚和单宁含量、降低VC含量，能提高酒体还原力，但对DPPH、ABTS+·清除率没有显著影响。

多酚、VC以及单宁对猕猴桃酒的营养品质和感官品质都有重要的影响，研究发酵过程中总多酚、VC及单宁的变化以及在成品酒中的含量、成品酒的抗氧化活性对于提高猕猴桃酒的品质有十分重要的意义，但是关于发酵过程中多酚、VC及单宁变化的机理需要进一步的试验研究。