李泮霖，刘宏，廖弈秋，李沛波，姚宏亮，苏薇薇

(中山大学生命科学学院∥广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心∥广东省热带亚热带植物资源重点实验室，广东 广州 510275)

丹红注射液由丹参、红花两味药组成，具有活血化瘀、通脉舒络的功效，临床上用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风，冠心病、心绞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病，缺血性脑病、脑血栓。由其功能主治可以看出，抗血栓作用是丹红注射液发挥药效的关键。现代研究表明，在激光诱导的大鼠动脉血栓模型[1]和大鼠急性血瘀模型[2]中，丹红注射液均显示出很好的抗血栓、溶栓作用；对其相关的药理作用机制，也进行了一些初步探讨[3-4]。但是，目前的研究仍仅关注单个或少数几个指标及蛋白的变化，未能对其多成分多靶点作用机制进行解释。

网络药理学技术整合了化学、医学、生物数据，使用计算模拟建立药理学性质预测模型，为阐明中药复方制剂多成分、多靶点作用机制及其相应的药效物质基础提供了一种可行的方法[5]。本研究采用Surflex-Dock分子对接方法，研究丹红注射液化学成分与抗血栓靶点间的相互作用，并建立其化学成分-靶点网络，为阐明丹红注射液抗血栓作用的分子机制提供依据。本研究对于丰富丹红注射液的科学内涵，指导其临床用药具有实际意义。

1 方 法

1.1 化学成分

前期已采用UFLC-PDA-Triple TOF-MS/MS技术[2]，确证及指证了丹红注射液中的82个化学成分，并明确了各成分的药材归属。通过检索NCBI PubChem数据库(http:∥www.ncbi.nlm.nih. gov/pccompound)及Chemical Book 数据库(http:∥www.chemicalbook.com)，获得各化学成分的分子结构，其结构文件均储存为mol格式，作为分子对接的配体。

1.2 抗血栓作用相关靶点数据库

前期已建立了抗血栓作用相关靶点数据库[6]，该数据库由115个候选蛋白质靶点组成，其X射线晶体结构从RCSB Protein Data Bank(http:∥www. pdb.org/)中下载，作为分子对接的受体。

1.3 分子对接

采用计算机模拟分子对接方法，以蛋白质-配体复合物的晶体结构为中心，参考缺省参数进行各化学成分与各候选蛋白靶点的分子模拟对接。以Surflex-Dock预测的分子受体和配体的最佳对接姿态的结合能作为评价参数，将与每个分子配体(各化学成分)结合能大于6的分子受体(各候选蛋白靶点)作为阳性结果(潜在靶点)，用于构建成分-靶点网络[6]。

1.4 网络的构建与分析

利用Cytoscape3.3.0软件(http:∥www.cytoscape.org/)对计算结果进行可视化处理，构建成分-靶点网络。应用Cytoscape软件中的ClueGO插件，对丹红注射液抗血栓作用相关靶点进行KEGG信号通路分析，设定P<0.05。

2 结 果

2.1 丹红注射液成分与抗血栓作用相关靶点分子对接结果

将丹红注射液82个化学成分，分别与抗血栓相关靶点数据库中的115个蛋白靶点进行分子对接，结果表明：丹红注射液中有60个成分与106个抗血栓作用靶点间存在2 028条关联(表1、表2)，使用Cytoscape软件进行可视化处理，构建了成分-靶点网络图(图1)。

从表1可以看出，在与丹红注射液成分有关联的潜在靶点中，与血栓形成关联密切的重要靶点排名均很靠前，包括F2(凝血因子Ⅱ)、REN(肾素)、F13A(凝血因子XIIIa)、PROC(蛋白C—凝血因子Ⅴa及Ⅷa抑制剂)、PGH2(前列腺素G/H合酶2)、ACE(血管紧张素转化酶)、PLAU(尿激酶型纤溶酶原激活物)和SERPINC1(抗凝血酶)等，这些靶点分别涉及凝血、纤溶系统以及血管生成、收缩舒张等多个系统，提示这些靶点是丹红注射液的主要药效靶点。

表1 丹红注射液的潜在抗血栓作用靶点(关联化合物数≥35)Table 1 The potential anti-thrombotic targets of Danhong Injection

从表2可以看出，丹红注射液中丹酚酸类成分与大多数血栓靶点均有较好的结合，表明丹酚酸类是丹红注射液抗血栓作用的主要药效物质基础。

表2 丹红注射液的抗血栓活性成分Table 2 The anti-thrombotic compounds in Danhong Injection

续表2

1) 化合物编号与文献[2]一致

同时，通过ClueGO插件对丹红注射液抗血栓作用靶点涉及的KEGG信号通路进行分析，结果如图2所示。从图2可以看出，丹红注射液抗血栓作用靶点主要富集于Complement and coagulation cascades、cAMP signaling pathway、Calcium signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、Renin-angiotensin system信号通路等。

图1 丹红注射液成分-抗血栓作用相关靶点网络图(化合物编号对应的化合物名称见表2)Fig.1 The compound-antithrombotic target network of Danhong Injection( The compound name corresponding to the compound No. was showed in Table 2)

2.2 丹红注射液指纹图谱色谱峰的靶点分析

前期我们构建了丹红注射液生物活性指纹图谱[2]，包括13个主要色谱峰，分别为5-羟甲基糠醛(1)、丹参素(2)、原儿茶醛(3)、羟基红花黄色素A(4)、对香豆酸(5)、丹酚酸H(6)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、紫草酸甲酯(9)、迷迭香酸(10)、紫草酸(11)、丹酚酸B(12)、丹酚酸A(13)。因此，对这13个色谱峰的相关靶点作进一步分析(图3)。

图2 丹红注射液抗血栓作用的成分-靶点-信号通路网络图(化合物编号对应的化合物名称见表2)Fig.2 The compound-antithrombotic target-signaling pathway network of Danhong Injection(The compound name corresponding to the compound No. was showed in Table 2)

图3 丹红注射液13个指纹图谱色谱峰的靶点分析1: 5-羟甲基糠醛; 2: 丹参素; 3: 原儿茶醛; 4: 羟基红花黄色素A; 5: 对香豆酸；6: 丹酚酸H；7: 丹酚酸I；8: 丹酚酸D；9: 紫草酸甲酯；10: 迷迭香酸；11: 紫草酸；12: 丹酚酸B；13: 丹酚酸AFig.3 The target analysis of 13 main compounds in Danhong Injection1：5-Hydroxymethyl furfural；2：Danshensu；3：Protocatechualdehyde；4：Hydroxysafflor yellow A；5： p-Coumaric acid；6：Salvianolic acid H；7：Salvianolic acid I；8：Salvianolic acid D；9：Monomethyl lithospermate；10：rosmarinic acid；11：Lithospermic acid；12：Salvianolic acid B；13：Salvianolic acid A

结果表明，13个色谱峰与凝血、纤溶系统以及血管生成、收缩舒张等多个系统的靶点具有相互关联。关联靶点较多的成分为丹酚酸A(13)、迷迭香酸(10)、丹酚酸H(6)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、丹酚酸B(12)；而5-羟甲基糠醛(1)、原儿茶醛(3)、对香豆酸(5)关联靶点个数较少，说明其对抗血栓药效贡献较小。

3 讨 论

通过本研究，得出106个蛋白靶点与60个丹红成分间存在2 028个相互作用。其中，F2、F13A、SERPINC1、PGH2、ACE、REN、PLAU和PROC是已知与血栓形成密切相关、且与丹红注射液化学成分有较强结合的靶点；在抗血栓活性成分中，丹酚酸类成分占主导地位。

F2、F13A同为凝血因子，通过外源性和内源性凝血途径的级联传递介导凝血酶原酶复合物的形成、凝血酶原的转变以及最终的凝血过程和血栓形成；其中F2在整个过程中发挥着核心作用[7]。SERPINC1是血浆中最重要的抗凝物质之一，可抑制50%～60%的凝血酶和凝血因子Ⅶa、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺ、Ⅻa的激活，从而阻止血液凝固。PGH2可以影响花生四烯酸诱导的血小板聚集和血栓形成[8]。除了上述凝血和抗凝系统的关键靶点，丹红注射液抗血栓作用的主要靶点还包括肾素-血管紧张素系统中的REN和ACE，与血压的稳定和调节直接相关[9]。研究表明，ACE作为RAS系统最主要的成员，除介导血管平滑肌细胞收缩引起血压升高外，还介导血管壁的慢性炎症反应，进而参与动脉粥样硬化的发生与发展[10]。此外，丹红注射液还与纤溶系统的PLAU和PROC靶点关联密切。PLAU作为纤溶酶原的激活剂，通过激活PLG(纤溶酶原)为纤溶酶发挥溶栓作用。PROC可同时作用于抗凝系统及纤溶系统，其被激活后，在磷脂和Ca2+存在时，可灭活FⅤa、FⅧa；阻碍FⅩa与血小板上的磷脂结合，削弱FⅩa对凝血酶原的激活作用；刺激纤溶酶原激活物释放，增强纤溶酶活性，促进纤维蛋白溶解[11]。

靶点信号通路分析结果显示，丹红注射液活性成分相关的作用靶点主要参与Complement and coagulation cascades、cAMP signaling pathway、Calcium signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、Renin-angiotensin system等信号通路。这些通路涉及凝血功能、内皮功能、血管收缩舒张等多个方面，共同维护机体血液循环系统的动态平衡，抑制血栓形成或出血[12]。丹红注射液同一成分或不同成分同时作用于多个通路的靶点，也体现了中成药多成分、多靶点、综合调控的作用特点。

中药成分复杂，单个成分在体内的浓度往往达不到其有效浓度[13]，但在动物实验及临床中，又可观察到较好的疗效。本研究中，丹红注射液多个成分同时与凝血通路中的不同靶点相互作用，可能由此引发凝血级联效应而发挥药效。整体药效到底是由于不同成分间的相互协同、加和还是拮抗，尚有待进一步研究。

在丹红注射液指纹图谱13个主要色谱峰中，丹参素(2)、羟基红花黄色素A(4)、对香豆酸(5)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、紫草酸甲酯(9)、迷迭香酸(10)、紫草酸(11)、丹酚酸B(12)、丹酚酸A(13)为核心活性成分群[2]。本研究中，网络药理学结果表明，丹酚酸A(13)、迷迭香酸(10)、丹酚酸H(6)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、丹酚酸B(12)关联靶点较多。两种方法获得的丹红活血化瘀活性成分基本一致，可以相互印证。本研究为进一步阐明丹红注射液多成分、多靶点分子作用机制提供了依据。