许桂丹 肖树荣 邓益斌

【关键词】乙肝病毒；乙肝；基因治疗

中图分类号：R459.9文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.025

乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染呈世界性分布，是一种以引起宿主肝细胞炎性和损坏病变为主要特征的传染性疾病。全球约有2.4亿慢性乙肝病毒携带者（chronic hepatitis B， CHB），每年由HBV感染引起肝硬化、肝癌等严重病变而致患者死亡近70万人，已成为目前全球性健康问题[1]。我国是HBV感染高发区，HBV携带者近亿人，其中有20%～30%患者发展为肝硬化、肝癌等严重病变，且呈逐年递增趋势[2]。目前，临床抗HBV治疗的药物主要有干扰素、核苷类似物、中草药等。其中干扰素通过作用于细胞表面受体促使细胞产生抗病毒蛋白，调节免疫功能，进而发挥病毒抑制作用，但毒副作用大，长期使用可影响患者的造血功能；核苷类似物通过竞争抑制HBV聚合酶活性，从而阻断病毒DNA的复制，但长期使用可引起病毒变异产生耐药；而中草药的抗病毒疗效又不明确。近年来，随着基因治疗研究的不断深入，其抗病毒作用的研究也引起了人们的广泛关注，本文拟对反义治疗、反基因治疗、衣壳蛋白靶向灭活（Capsid-targeted viral inactivation，CTVI）、显性负性突变体（Dominant negative mutants，DNM）、新型基因编辑等技术作一综述，以期为抗HBV基因治疗研究提供参考。

1HBV生物学及其感染复制周期

HBV是由3.2 kb组成、具有包膜的部分双链松弛环状DNA（relaxed circular DNA， rcDNA）嗜肝病毒，包括S、C、P和X四个开放读码区（open reading frame， ORF），其中S和C区是保守区，也是基因治疗的理想靶位。HBV感染过程包括，①侵入：HBV与受体结合后进入肝细胞，脱去包膜形成含有rcDNA的核心颗粒，然后进入细胞核，在DNA聚合酶的作用下形成cccDNA。②转录：以cccDNA作为模板，转录成前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）和信使RNA（messenger RNA，mRNA）并进入胞浆。③翻译：pgRNA、mRNA共同作用翻译成HBV各种蛋白，包括HBX、HBsAg（外膜蛋白）、HBeAg/HBcAg（即核壳蛋白）、DNA多聚酶等。④逆转录：以pgRNA为模板经一系列酶促逆转录先后形成负链DNA，正链DNA，含有rcDNA的核心颗粒。⑤装配：步骤③④中形成的各种病毒蛋白、酶和含有rcDNA的核心颗粒装配形成完整的HBV并释放至肝细胞外。此外部分含有rcDNA的核心颗粒再次入核补充cccDNA库。HBV的感染复制周期可为基因治疗靶位的选择、定位和效果评估提供重要的理论科学依据。

2抗 HBV基因治疗

2.1反义治疗反义技术是根据碱基配对的原理人工设计的反义基因片段与体内某些特定基因位点中的DNA或RNA互补，从而控制该基因的表达，阻断相应蛋白质的产生[3]。目前，HBV的反义治疗主要包括反义DNA、反义RNA、核酶技术和RNA干扰（RNA interference， RNAi）。

2.1.1反义DNA早在1995年，陈常庆等[4]就对反义DNA抗HBV的抑制效果作了研究，虽然 PreS区及C区的反义DNA片段抑制效果明显，但是硫代合成的DNA片段有一定的毒性，且毒性大小与硫代数量成正比。由于稳定性和毒性的缘故，反义DNA在抗HBV研究上受到限制。近几年，锁核酸（locked nucleic acid，LNA）由于具有热稳定性和脂溶性好，分子杂交能力和抗核酸酶降解能力强以及细胞毒性低等优势[5]，成为核酸研究领域的新热点。Deng YB等[6]针对乙肝病毒保守区S、C设计反义LNA片段，观察其对转基因小鼠体内HBV复制的影响，结果发现，反义LNA对HBV复制和表达均有较显著的影响，单靶区S，单靶区C和雙靶区SC各组对HBsAg表达的平均抑制率分别为36.63%，31.50%和5487%，对HBV DNA复制的平均抑制率分别为2397%，21.13%和35.83%；在注射后的1、3、5 天，HBsAg的平均抑制率分别为14.40%，25.61%和3133%，HBV DNA的平均抑制率分别为1104%，19.24%和24.13%；且肝、肾功能指标未发现异常，结果表明HBV S/C基因位点的反义LNA能较强地抑制转基因小鼠HBV的复制和表达且无毒副作用，双基因靶位抑制效果优于单基因靶位。同样的试验对前C/C双靶区反义LNA进行研究，再一次证明针对互补于保守区的LNA片段可较强地抑制HBV的复制且无毒副作用，且双靶区抑制效果明显高于单靶区[7]。反义DNA为乙肝基因治疗提供了新的实验依据。

2.1.2反义RNA20多年的抗HBV反义RNA治疗研究表明，它能显著抑制HBV复制，是比较理想的基因治疗策略[8～10]。反义RNA片段能干扰乙肝抗原的生成，有效抑制HBV病毒的复制，在细胞试验中抗原表达抑制率高达60%～75%，但是对HBV复制和转录水平影响不大[10]。筛选出有效的靶点十分重要，Nash等[11]设计互补于HBV mRNA水平上的包装信号ε，HBs和HBx蛋白的反义RNA片段，用慢病毒载体介导转染，结果显示针对HBs蛋白的反义RNA片段能有效抑制HBV的复制，而针对HBx蛋白的反义RNA片段则是无效的，同时慢病毒载体可以使基因片段持续表达长达4个月。Billioud等[9]的细胞和动物试验结果显示，特定的反义寡核苷酸能有效抑制HBV的复制，联合使用恩替卡韦效果更佳，因此在临床治疗乙肝上可以考虑联合用药的方式来增强疗效。

2.1.3核酶技术核酶技术包括核酶和脱氧核酶。核酶是指能特异性地剪切mRNA片段，从而阻断mRNA的表达，具有催化活性的特殊反义RNA。研究表明靶向性的核酶片段能有效抑制HBV的复制[11]。Xia等[12]利用核酶针对HBV pgRNA的PreS1和表面区域设计的核酸序列，以沙门氏菌介导转染的小鼠动物实验中，HBV基因的表达水平抑制率高达95%，HBV DNA水平减少高达200 000倍。脱氧核酶是指能催化切割特定的RNA或DNA的酶。Hou等设计互补于HBV的X蛋白，S基因和C基因的10～23个不同长度的脱氧核酶片段进行细胞试验，结果能分别显著下调HBx，HBsAg和 HBeAg的蛋白水平，有效抑制HBV病毒复制，而且细胞毒性试验显示其对细胞未见毒副作用[13～14]。但是，由于核酸酶存在活性期短、易被破坏、价格昂贵、难分离和纯化等缺点限制了其在抗HBV基因治疗上的应用。

2.1.4RNAi由高度保守的短双链RNA诱导同源RNA降解，引起转录后特异基因的沉默现象称RNAi，国内外学者对RNAi技术在乙肝基因治疗领域已经做了大量研究，并且它的功能性和高效性已得到普遍认可[15]。通过深入研究病毒进入细胞过程的详细机制，Verrier等[16]发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5在病毒入胞、细胞分裂和生长以及肝癌等HBV相关疾病中起重要作用，可以作为新靶点应用于RNAi和其他基因治疗方法的研究上。基于RNAi原理研发的ARC-520基因药物，在mRNA水平上封闭HBV某些蛋白的表达，有望成为功能性治愈乙肝的CHB药物，是已经被美国食品药品监督管理局批准的功能性治愈乙肝药物。Schluep等[17]对54名健康志愿者进行ARC-520安全性、耐药性、药代动力学和药物不良反应的试验，评估结果良好，虽少量出现过敏反应，而过敏反应可以口服抗组胺药物应对。但是，ARC-520基因药物在广泛应用于临床之前，其安全性和实用性还需要更多的实验数据和临床结果的支持。

2.2反基因治疗反基因治疗技术已广泛应用于治疗肿瘤和病毒性疾病方面的研究，但在抗HBV治疗方面的研究报道较少。Deng YB等[18]针对HBV S、PreS1、PreS2等基因同聚嘌呤区设计反基因LNA片段，并观察其对细胞内病毒复制和转录的影响，结果发现，互补于S基因同聚嘌呤区的LNA转染hepG22.15细胞6天后，对HBV DNA复制、HBsAg、HBeAg的表达抑制率分别达52.4%，57.48%和2963%。针对HBV PreS1基因作同样的试验也得到类似的结论，转染7天后，HBV DNA复制、HBsAg及PreS1的表达受到明显的抑制，抑制率分别为6599%，67.49%和63.88%[19]。针对PreS2的LNA序列研究中，用半乳糖配体介导转染HepG2.2.15细胞，7 d后对HBV DNA复制、HBsAg和PreS2抗原的表达抑制率分别达61.56%、68.18%和7282%[20]。反基因LNA有望成为新的抗病毒核酸分子药物。

2.3衣壳蛋白靶向灭活（Capsid-targeted viral inactivation，CTVI）CTVI是通过将病毒的衣壳蛋白与核酸酶的融合蛋白靶向地导入至病毒颗粒内部，使病毒核酸降解，起到抑制病毒复制的目的。Beterams等[21]研究发现金黄色葡萄球菌酶与核心蛋白的融合蛋白作用于细胞后，能干扰HBV衣壳内病毒DNA的合成或导致的DNA快速降解。利用CTVI构建的核心蛋白（Core）与载脂蛋白B mRNA编辑酶多肽3C（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide，APOBEC3C，又简称A3C），转染于HepG2细胞中，core-A3C可以使HBV基因组发生腺嘌呤（A）→鸟嘌呤（G）的突变急剧增多，HBV的复制受到明显的抑制[22]。

2.4显性负性突变体（Dominant negative mutants，DNM）等位基因中其中一个失活或突变导致另一个正常等位基因也丧失功能活性，都称DNM。1994年Scaglioni等[23]对DNM应用与乙肝基因治疗研究进行了首次报道，他们根据病毒蛋白的DNM能使野生型蛋白质的功能失活从而能够抑制病毒复制的原理，设计出了能使核心蛋白突变的融合蛋白，可以使HBV病毒复制的抑制率高达90%～95%。刘伟侠[24]基于显性负性突变体原理构建的融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN，作用HepG2.2.15细胞发现其能抑制HBV pgRNA在核心颗粒内的包装，有效抑制HBV的复制，且其抑制效果与作用浓度和时间有关。然而，该策略中一些混合粒子往往存在病毒逃逸机制从而还有复制能力。

2.5新型基因编辑技术锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases， ZFN）、轉录激活因子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和CRISPR/Cas9[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated（Cas9），CRISPR/Cas9]三大新型基因编辑技术的应用为HBV基因治疗开辟了新途径。Winer等[25]发现可以利用ZFN靶向干预小鼠受精卵成功造出HBV小鼠模型，该研究也为人类其他疾病的模型构造提供了新思路，具有重要的社会意义。Chen等[26]构建了互补于HBV保守区的TALEN序列，细胞和小鼠动物试验结果显示TALEN序列通过特异结合及切割病毒基因组的方式导致HBeAg、HBsAg、HBcAg、pgRNA和cccDNA的水平明显降低，同时，联合使用TALEN和α干扰素，抗HBV效果更佳。Seeger等[27]通过新一代测序技术NGS发现CRISPR/Cas9能够切割90%以上的HBV DNA，而且其编辑基因的效率比α干扰素作用高达1500倍以上，从而认为CRISPR/Cas9是目前治疗CHB达到功能灭活HBV cccDNA的最佳方法。

3问题与展望

目前，探索出完全清除HBV cccDNA达到治愈乙肝的安全、高效、特异、经济的药物仍是全球乙肝治疗研究人员努力的方向。乙肝基因治疗的各种策略都存在自身的优点和不足，反义治疗的靶标主要是mRNA，在病毒蛋白的合成上有较强的抑制作用，但对HBV的复制和转录水平影响甚少，容易出现停药反复，与之相比，反基因治疗和新型基因编辑技术有在复制和转录水平上阻断HBV的优势，尤其是反基因治疗、TALEN和CRISPR/Cas9有清除cccDNA的潜能，但由于HBV DNA存在于细胞核中，以其为靶标的药物必须克服核孔障碍以提高药物的靶向性和稳定性。CTVI特异性不强且有一定的毒副作用，DNM往往还存在病毒逃逸机制，在基因治疗应用上受到一定限制。因此，乙肝的基因治疗绝不是单靠某种策略就能一蹴而就，笔者认为，要征服乙肝，需要从以下几方面努力：①探索出特异性强的方法，筛选出疗效显著的基因靶位，对基因药物的修饰方法和介导物质作好评估和筛选，进一步研发出安全性高、稳定性好、作用持续性长、副作用小和细胞毒性低的新型强效药；②多基因靶位和多手段的联合治疗方案，显示出一定的优越性[6，7，9，26]，是治疗HBV的研究趋势；③增加投资，促进抗HBV的临床基础研究和基因治疗的全球合作。

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