吴映璇, 谢敏玲, 姚仰勋, 蓝 草

(广东检验检疫技术中心, 广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室, 广东 广州 510623)

牛奶和羊奶,因其较高的营养价值备受消费者青睐,同样其安全问题也引起了人们的普遍关注,特别是兽药残留问题[1-5]。奶中的兽药残留主要是由于产奶动物使用兽药后,兽药或其代谢物进入生乳中并由此对消费者带来健康隐患。氨基乙腈衍生物莫奈太尔是一种新型的驱虫药,可以有效杀灭耐受其他类别药物的线虫[6]。国外已有大量研究表明该药具有良好的抗虫效果、毒性低且不容易产生耐药性,在寄生虫感染防治方面具有很广阔的应用前景[7-12],同时也制定了最大残留限量。欧盟37/2010规定:牛奶和羊奶中莫奈太尔的标志残留物为莫奈太尔砜,最大残留限量为0.17 mg/kg[13]。澳大利亚农兽药局发布2017年第3号公报,拟修订《澳新食品标准法典》附表20,对牛奶中莫奈太尔残留限量规定为0.05 mg/kg[14]。我国尚未制定出最大残留限量。研究发现,莫奈太尔经口给药后,在动物体内被吸收并快速氧化为亚砜,亚砜又进一步氧化为砜[6]。因此,建立有效的莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜的检测方法,可为牛奶和羊奶中莫奈太尔的代谢研究提供有效可行的检测方法,为研究养殖过程中产奶动物用药后3种药物在牛奶和羊奶中的分布情况提供技术支撑,为制定国内牛奶和羊奶中莫奈太尔的最大残留限量提供基础数据,对有效控制牛奶和羊奶产品中莫奈太尔的残留,促进畜牧养殖业的健康发展,保障广大人民群众的身体健康,具有深远的意义。

Kinsella等[15]测定了牛奶和绵羊肌肉中莫奈太尔和莫奈太尔砜,样品提取后需要两次净化处理,采用内标法定量,但所采用的内标并不是其对应的同位素内标,在色谱分离过程中,保留时间相差至少1 min以上,两者之间的色谱和质谱行为差异大,未能补偿莫奈太尔和莫奈太尔砜由于基质效应的影响引起的响应信号的改变,未能起到同位素内标的校正作用。本工作在前人研究的基础上以牛奶和羊奶为样品基质,采用稀释的方法,减少了负载在色谱柱上的基质,从而减弱了基质效应。采用基质标准曲线校正定量结果,减少基质效应的同时降低了前处理成本,采用高效液相色谱-三重四极杆质谱(HPLC-MS/MS)结合固相萃取(SPE)净化等技术,建立了牛奶和羊奶中莫奈太尔及其代谢产物残留量的检测方法。该方法操作简便,前处理成本低,灵敏度高,抗干扰能力强,定性定量准确,弥补了国内牛奶和羊奶中莫奈太尔及其代谢产物检测方法的空白,为我国建立莫奈太尔最大残留限量提供数据支持与技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

UFLC LC-20A DXR高效液相色谱仪(日本岛津公司); API 4000 QTRAP三重四极杆串联质谱仪,配ESI离子源(美国Sciex公司);Turbovap LV吹氮浓缩仪(美国Zymark公司);涡旋振荡器(德国IKA公司);超纯水机(美国Millipore公司)。

莫奈太尔(纯度>99.0% )、莫奈太尔亚砜(纯度>99.0% )和莫奈太尔砜(纯度>99.2% )标准品(美国Witega公司);乙腈、甲醇(色谱纯,美国Tedia公司);乙酸铵(优级纯,印度Fluka公司);去离子水由Millipore公司超纯水机制得;中性氧化铝SPE柱(1 g/3 mL,美国色谱科公司),用3 mL乙腈活化,备用。

定容液:量取90 mL甲醇和10 mL 0.5 mmol/L乙酸铵溶液,混合,摇匀备用。

1.2 样品前处理

取市售具有代表性的羊奶(牛奶)样品500 mL,混合均匀,密封并标明标记,于4 ℃保存。

称取2 g样品(精确至0.01 g)至50 mL的离心管中,加入18 mL乙腈,涡旋振荡10 min, 4 000 r/min离心5 min,上清液转移至25 mL带刻度比色管中,用乙腈定容至刻度,摇匀,备用。吸取2.5 mL样品提取液过中性氧化铝SPE柱(用3 mL乙腈预活化),收集流出液,再用2 mL乙腈淋洗SPE柱,合并收集的流出液至10 mL试管中,在50 ℃水浴中氮吹浓缩至干。残渣用2.0 mL甲醇-0.5 mmol/L乙酸铵(9∶1, v/v)溶解,涡旋振荡1 min,超声3 min,经0.2 μm滤膜过滤后,供HPLC-MS/MS测定。

1.3 色谱条件

Inertsil C8-3色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,日本岛津公司);流速:0.80 mL/min;流动相:A:甲醇;B:0.5 mmol/L乙酸铵溶液;梯度洗脱:0～3 min, 10%A～95%A;3～5 min,95%A;5～5.1 min,95%A～10%A;5.1～10 min,10%A。柱温:40 ℃;进样量:5 μL。

1.4 质谱条件

离子源:ESI源,负离子模式;离子源温度:400 ℃;喷雾电压:-4 500 V;气帘气压力:207 kPa;雾化气压力:414 kPa;辅助加热气压力:483 kPa;碰撞气压力:76 kPa;待测物的其他参数见表1。

表 1 莫奈太尔及其代谢产物的保留时间、母离子、子离子、去簇电压和碰撞能量Table 1 Retention times, precursor ions, product ions, declustering potentials and collision energies of monepantel and its metabolites

* Quantitative ion.

2 结果与分析

2.1 净化条件的优化

由于牛奶和羊奶中含有大量的蛋白质以及非极性磷脂类干扰物,容易形成基质干扰,因此必须对其进行净化处理,以达到减少基质效应的效果。净化的方式主要有液液分配和SPE两种方式[16,17]。本研究以羊奶为样品基质,分别比较了Prime HLB (3 mL/6 mg,美国沃特世公司)、中性氧化铝和HLB (3 mL/6 mg,美国沃特世公司) 3种SPE小柱的净化方式。结果显示,HLB小柱净化效果最差,各药物的回收率为44.2% ～57.9% ;采用Prime HLB小柱净化时各药物的回收率为75.0% ～83.9% ,中性氧化铝小柱净化效果最佳,各药物的回收率均高于90.1% 。因此,本研究采用中性氧化铝SPE小柱的通过式净化方式,净化效果佳,样品分析通量高,操作快速,同时保证了较高的回收率。此外,将提取液上柱后,分别采用0、1、2、3、4 mL乙腈进行淋洗。结果发现,采用2 mL乙腈比0 mL淋洗的回收率提高了3.9% ～9.7% ,淋洗体积继续增加,各药物的回收率没有明显变化。为避免SPE小柱上吸附的杂质被洗脱下来和减少后续实验时间,淋洗体积选择2 mL。空白羊奶样品及空白羊奶加标样品(添加水平2.0 μg/kg)的多反应监测色谱图见图1,可以看出,净化效果良好,无干扰。

2.2 定容液的优化

液相色谱-质谱联用分析一般采用流动相定容,因此本研究比较了不同比例的甲醇和0.5 mmol/L乙酸铵溶液定容莫奈太尔及其代谢产物混合标准溶液(25 μg/L)的分析效果。结果显示,甲醇-0.5 mmol/L乙酸铵溶液(9∶1, v/v)定容效果最好,能够将3种药物完全溶解,且定量离子的峰面积最高。而如果仅使用甲醇定容,可能导致部分目标物在流动相的水相比例较大时在色谱柱内析出,影响色谱柱及质谱寿命。基于此,本研究最终选择采用9∶1(v/v)的甲醇-0.5 mmol/L乙酸铵溶液定容检测。

2.3 色谱柱的选择

分别考察了Inertsil C8柱、Atlantis Hillic柱(100 mm×3.0 mm，3 μm, 美国沃特世公司)和Atlantis T3柱(100 mm×4.6 mm，3 μm, 美国沃特世公司)对莫奈太尔及其代谢产物进行色谱分离时的峰形和灵敏度。以莫奈太尔亚砜为例,如图2所示,当Inertsil C8柱作为色谱柱进行色谱分离时,目标物的色谱峰更窄,峰形更尖锐,灵敏度更高,因此选为实验所用。

图 1 空白羊奶及羊奶加标样品(添加水平2.0μg/kg)的MRM色谱图Fig. 1 MRM chromatograms of monepantel and its metabolites in blank sheep milk and sheep milk spiked with standards at 2.0 μg/kg

2.4 质谱条件的优化

用蠕动泵以10 μL/min的流速分别连续注射0.5 mg/L的莫奈太尔及其代谢产物混合标准溶液于ESI离子源中,在负离子检测模式下进行一级质谱扫描,得到分子离子峰[M+H]+,并对其进行二级质谱扫描,得到莫奈太尔及其代谢产物的二级质谱信息(见图3)。选取响应强度高、基线噪声低的两对离子对作为监测离子对,并在MRM模式下优化离子对的去簇电压、碰撞能量等质谱参数。

2.5 基质效应

基质效应在复杂样品基质的液相色谱-电喷雾质谱联用分析中普遍存在,一般认为可能是源于待测组分与样品中的基质成分在雾滴表面离子化过程的竞争。其结果会降低或增加目标离子的生成效率及离子强度,从而影响测定结果的精密度和准确度,很难甚至不能消除[18]。考察基质效应的常用方法有柱后灌注法[19]和测定值比较法[18],本研究采用测定值比较法考察了空白羊奶样品对莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜的基质效应。在所建立的仪器条件下,比较空白基质溶液添加5.0 μg/L莫奈太尔及其代谢产物时的测定值与同浓度的标准溶液测定值的比值,确定基质的增强或抑制效应,实验结果发现,羊奶样品基质对莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜的基质效应分别为110% 、108%和111% ,具有基质增强效应。为减少牛奶和羊奶样品基质在定量过程中产生的影响,本研究采用基质标准曲线校正定量结果。

2.6 线性范围、线性方程和检出限

用空白基质溶液(不含莫奈太尔及其代谢产物的羊奶样品)分别配制质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 μg/L的系列莫奈太尔及其代谢产物的基质匹配溶液,对其进行分析,以莫奈太尔及其代谢产物的峰面积为纵坐标(Y)、对应的质量浓度为横坐标(X, μg/L)作图,用最小二乘法进行线性回归,其线性方程及相关系数(r)见表2。当样品中的莫奈太尔及其代谢产物浓度超出0.1～5.0 μg/L这一线性范围时,可适当加大样品的稀释倍数。

在本方法测定条件下,以信噪比(S/N)≥ 3时基质标准溶液的浓度乘以方法的稀释倍数推算出方法检出限(LOD);选择空白羊奶样品,当添加水平为2.0 μg/kg时,信噪比≥10,表明其定量限(LOQ)可达到2.0 μg/kg,检出限及定量限结果见表2。

图 2 采用不同色谱柱分析莫奈太尔亚砜的MRM图Fig. 2 MRM chromatograms of monepantel sulfoxide separated using different columns

图 3 莫奈太尔及其代谢产物的二级离子质谱图Fig. 3 MS/MS spectra of monepantel and its metabolites

CompoundLinear equationrLOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)MonepantelY=4.79×103X+1.90×1020.99900.0192.0Monepantel sulfoxideY=7.09×103X+5.73×1020.99860.0172.0Monepantel sulfoneY=4.90×103X+1.91×1020.99790.0232.0

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L. Linear range: 0.1-5.0 μg/L

2.7 回收率和精密度

在空白样品基质中添加3个水平(2.0、50、100 μg/kg)的标准品进行加标回收试验,每个添加水平重复6次,结果见表3。结果表明,莫奈太尔及其代谢产物的回收率为90.1% ～103.3% ,相对标准偏差为2.0% ～6.2% ,方法的精密度和准确度能够满足定量分析要求。

2.8 实际样品测定

随机购买市售的国内外牛奶和羊奶样品15种,按照本研究建立的检测方法进行测定,15种样品中均未检出莫奈太尔及其代谢产物。

表 3 莫奈太尔及其代谢产物的加标回收率与精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precisions of monepantel and its metabolites (n=6)

3 结论

本研究采用乙腈沉淀蛋白质、中性氧化铝SPE柱净化,建立了同时测定牛奶和羊奶中氨基乙腈衍生物莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜残留的高效液相色谱-串联质谱检测方法,回收率、精密度和定量限均满足牛奶和羊奶中氨基乙腈衍生物莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜残留限量的要求。