王璐芳, 李春梅, 许佳彬, 李 慧, 苏 杭, 王 静, 金 芬*, 张 宇*

(1. 海南大学热带农林学院, 海南 海口 570228; 2. 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所, 北京 100081)

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(strobilurin fungicides)是一类广谱性杀菌剂,对担子菌纲、半知菌纲和卵菌纲等真菌具有高杀菌活性[1-5]。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂由于其独特作用机制及广谱杀菌活性,已成为继苯丙咪唑类和三唑类杀菌剂之后极具市场潜力的一类杀菌剂。目前甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂种类已达15种,其中肟菌酯、氟嘧菌酯和啶氧菌酯的农药市场占比分别达到18.45% 、5.52%和5.05%[6];此外,烯肟菌酯、丁香菌酯、烯肟菌胺、氯啶菌酯和唑菌酯等的登记使用范围也逐渐扩大,而有关此类杀菌剂的检测方法及残留水平等研究缺乏,有必要建立该类杀菌剂的多残留检测方法。大部分甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在施用后,会进入土壤,具有潜在的环境风险[7,8]。已有研究表明,脂溶性强的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在土壤中易与土壤有机质结合,也可通过雨水淋溶等方式进入水体,进一步影响水生生物,从而通过食物链威胁人类健康[9]。近年来甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的毒性也日益受到关注,醚菌酯、啶氧菌酯及肟菌酯能引起大鼠轻微肝细胞水肿[10]、赤眼蜂行为异常[11]及鱼类胚胎发育不正常[12-14]等。因此,研究建立土壤中的丁香菌酯、唑菌酯、烯肟菌胺、氯啶菌酯、肟醚菌胺、E-苯氧菌胺、醚菌酯、醚菌胺、啶氧菌酯、肟菌酯及氟嘧菌酯等11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的多残留分析方法对研究其环境行为及风险评估等具有重要意义。

目前,土壤中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留检测方法已有报道[15-18]。郭敏等[15]采用丙酮提取测定了土壤中的啶氧菌酯和肟菌酯。丁琦等[16]采用乙腈振荡提取、石油醚复溶后中性氧化铝柱层析净化法测定了土壤中丁香菌酯的残留。Herrerohernández等[17]采用甲醇提取了土壤中的嘧菌酯。然而,这些方法只针对其中几种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。

我国农业土壤类型丰富,主要包括南方红黄壤、黄土性土壤、干旱区土壤、东北森林草原土壤和砂土等。不同类型的土壤有机质含量、粘粒含量及酸碱度等理化性质差别很大,其所含的色素、腐殖质等极性杂质的含量亦有所不同,对农药的吸附特性也不同[19],因此,针对不同植被类型土壤进行提取净化的效果也有所不同。本文根据我国农业区土壤的分布和理化性质,采集了6种典型的植被类型土壤(黑土、红壤土、砂土、潮土、灰漠土、高山土),以此为研究对象,考察了不同净化剂对11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂回收率的影响,建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定土壤中多种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UPLC-MS/MS 8050(日本Shimadzu公司), ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美国Waters公司)。高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司),超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司),涡旋混合器(美国Scientific Industries公司),电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司), Milli-Q超纯水发生器(德国Merck公司)。

甲醇和乙腈均为HPLC级,购自德国Merck公司;N-丙基乙二胺(PSA, 40～60 μm)、C18(40 μm)和多壁碳纳米管(MWNT, 18～20 nm)购自天津博纳艾杰尔科技公司;石墨化碳黑(GCB, 38～120 μm)购自美国Sigma-Aldrich公司。11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂标准品纯度均大于90% ,其中丁香菌酯、唑菌酯和烯肟菌胺购自美国Chemtek公司,氟嘧菌酯、氯啶菌酯、醚菌酯、啶氧菌酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌胺和E-苯氧菌胺购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

标准溶液的配制:分别准确称取11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂标准品各10.0 mg,用甲苯定容至10 mL,配制质量浓度为1 000 mg/L的储备液,密封后避光存于4 ℃,备用。分别取上述配制好的单标准品储备液各1 mL,置于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度线,配制成20 mg/L的工作液,备用。

土壤样品:黑土、灰漠土、高山土、潮土、红壤土和砂土分别采自中国吉林、新疆、青海、河北、江西、海南6地,风干,过2 mm筛,4 ℃保存待用。6种土壤的理化性质见表1。

表 1 6种植被类型土壤的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of the six vegetation types of soil

CEC: cation exchange capacity.

1.2 样品前处理

准确称取风干的10.0 g土样于50 mL塑料离心管中,加入10 mL 0.1%(v/v)醋酸乙腈,涡旋混匀1 min,超声提取5 min,以6 000 r/min离心10 min,取1 mL上清液置于含有PSA和C18的5 mL离心管中,涡旋1 min,以6 000 r/min离心5 min,取上清液,过0.22 μm滤膜,待测。

1.3 LC-MS/MS条件

色谱条件:色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱,柱温为30 ℃,进样体积为1 μL。流动相A为甲醇,流动相B为水,流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0～1.0 min, 40%A, 60%B; 1.0～2.5 min, 60%A, 40%B; 2.5～4.0 min, 80%A, 20%B; 4.0～5.5 min, 90%A, 10%B; 5.5～8.5 min, 40%A, 60%B。

质谱条件:离子源为电喷雾离子源,正离子模式,扫描方式为多反应监测。11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的质谱参数见表2。

表 2 11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的保留时间和质谱参数Table 2 Retention time and mass parameters of the 11 strobilurin fungicides

表 2 (续)Table 2 (Continued)

* Quantitative ion.

图 1 11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(50 μg/kg)在不同流动相条件下的色谱图比较Fig. 1 Comparison of chromatograms of the 11 strobilurin fungicides (50 μg/kg) in different mobile phases

2 结果与讨论

2.1 LC-MS/MS条件优化

本研究比较了有机相甲醇和乙腈对11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂分离效果的影响,如图1所示,当采用乙腈-水作为流动相进行分离时,仅丁香菌酯、肟菌酯、唑菌酯、醚菌胺和E-苯氧菌胺的响应值较高,氟嘧菌酯未出峰,这可能是因为氟嘧菌酯极性较强,应使用极性更强的甲醇对该药进行洗脱。而当采用甲醇-水作为流动相时,氟嘧菌酯出峰(保留时间为2.62 min), 11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂均得到较好分离,保留时间为2.20～3.81 min,且氯啶菌酯、唑菌酯和醚菌酯等峰的响应均有所提高。这可能是因为甲醇属于质子性有机溶剂,使目标物更容易质子化,提高了目标物的洗脱能力,从而提高了检测的灵敏度[20]。因此,本研究选择甲醇-水作为分离11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的流动相。

2.2 净化条件的优化

近年来QuEChERS在提取土壤及食品中的农药上应用广泛[21,22]。针对土壤基质较为复杂,含有有机质及色素等多种杂质,本文采用QuEChERS方法对土壤基质中的干扰物进行净化,提取11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。目前,QuEChERS方法常用的吸附净化剂主要包括GCB、MWNT、C18和PSA等,其中GCB和MWNT对色素有较好的吸附效果,PSA对土壤中的极性共提取物有较好的吸附,而C18可以去除基质的非极性杂质[23]。本文首先比较了4种不同净化剂(GCB、MWNT、C18及PSA各50 mg)对超纯水中11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的吸附效果。结果表明,GCB和MWNT对11种目标物有较强的吸附能力,几乎将丁香菌酯、氯啶菌酯、烯肟菌胺及唑菌酯全部吸附。又以有机质含量最高的黑土作为基质进行净化研究,发现经GCB和MWNT处理后的土壤基质中丁香菌酯、氯啶菌酯、烯肟菌胺和唑菌酯的回收率仅为3.38% ～62.53% ,进一步验证了这两种净化剂对目标物有较强的吸附能力[24],不适合对土壤中丁香菌酯、氯啶菌酯等药物的净化。而经PSA和C18处理后的土壤基质中目标物回收率为30.6% ～94.9% ,且与GCB和MWNT相比,PSA可吸附部分色素,达到净化除色的效果,因此本研究选择PSA和C18作为吸附净化剂。

进一步优化PSA和C18的用量与组成。如图2所示,当100 mg PSA和100 mg C18单独使用时,除E-苯氧菌胺外,其余10种目标物的回收率均较低;当PSA和C18用量分别提高至200 mg时,回收率得到较大提高,达到80.5% ～95.4% ;当100 mg PSA和100 mg C18净化剂混合使用时,11种目标物的回收率为94.1% ～112.1% ,能更好地满足检测需要。因此,最终选择100 mg PSA和100 mg C18作为该方法的吸附剂。

图 2 不同量的PSA和C18对黑土中11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的净化效果(n=3)Fig. 2 Effects of different amounts of PSA and C18 on the purification of the 11 strobilurin fungicides in black soil (n=3)

CompoundMoisture soilSandy soilBlack soilRed soil Plateau soilDesert grey soilCoumoxystrobin0.870.850.860.870.850.91Picoxystrobin0.870.820.891.030.961.04Tricyclopyricarb0.930.860.951.041.001.08Fluoxastrobin0.890.830.911.050.971.05E-Metominostrobin0.920.850.951.001.001.04Fenaminstrobin0.950.880.961.121.081.12Orysastrobin0.910.850.941.091.021.06Trifloxystrobin0.890.830.880.970.940.97Pyraoxystrobin0.940.870.920.970.951.02Dimoxystrobin0.890.830.860.930.900.94Kresoxim-methyl0.860.810.840.900.880.94

2.3 基质效应

基质效应(ME)指样品提取液中除目标物外的其他组分对定量分析准确性和重现性的影响[25],采用式(1)计算:

ME=km/ks

(1)

其中km为基质标准曲线的斜率,ks为溶剂标准曲线的斜率。参照1.2节方法对空白土壤样品进行前处理,制备空白基质溶液。分别用纯溶剂和空白基质溶液配制药物浓度相同的工作液,在相同仪器条件下检测,以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制基质标准溶液和纯溶剂标准曲线,并计算基质效应。结果如表3所示,6种不同类型植被土壤中11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的ME值为0.81～1.12,基质效应相对较小,表明本文所建立的QuEChERS前处理方法对目标药物的提取净化效果较好。11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在潮土、砂土和黑土3种土中均呈现微弱的基质抑制效应,ME值为0.81～0.96;而在红壤土、高山土和灰漠土中11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂则呈现了不同的基质效应。丁香菌酯、肟菌酯、唑菌酯、醚菌胺和醚菌酯等5种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在红壤土、高山土和灰漠土(除唑菌酯外)中均呈现为弱的基质抑制效应(ME值为0.87～0.97);啶氧菌酯、氯啶菌酯、氟嘧菌酯、E-苯氧菌胺、烯肟菌胺和肟醚菌胺等6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在红壤土、高山土(除氟嘧菌酯和啶氧菌酯外)和灰漠土中均表现为微弱的基质增强效应,ME值为1.00～1.12。因此,采用基质标准溶液对样品进行定量分析,以减少基质效应对实验结果的影响。

2.4 方法的线性范围和检出限

如表4所示,采用优化后的分析方法,将配制的工作液用处理后的空白土壤基质逐级稀释成质量浓度为100、50、20、10、5、2、1、0.5和0.1 μg/kg的基质匹配标准混合溶液,以质量浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,绘制基质匹配标准曲线。11种杀菌剂在0.1～100 μg/kg范围内线性关系良好,相关系数(R2)为0.980 5～0.999。分别以3倍和10倍信噪比确定该类药物在土壤中的检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果见表4。11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在6种土壤中的LODs值为0.005～2.3 μg/kg,低于现有文献方法[26,27]的LODs,可以满足我国土壤中11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的痕量检测要求。

表 5 不同植被类型土壤中11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的平均回收率和相对标准偏差(n=3)Table 5 Average recoveries and RSDs of the 11 strobilurin fungicides in different vegetation types of soil (n=3)

2.5 方法的准确度和精密度

在6种空白土壤中分别添加5、10和50 μg/kg水平的11种杀菌剂的混合标准液,每个水平重复3次,按照本方法对样品进行提取并检测,得到各添加水平下的平均回收率分别为65.1%～90.6% 、73.8%～95.8% 、80.5%～103.9% ,相对标准偏差(RSD)为0.082%～7.8% 、0.13%～5.6% 、0.12%～14.0% ,结果见表5。

2.6 实际样品的检测

采用本文所建立的方法,分别对3个采自不同地点(河北、北京和海南)的土壤样品进行检测。在河北和海南的土壤样品中均检出了丁香菌酯(含量分别为0.1和0.2 μg/kg)、氯啶菌酯(均为0.2 μg/kg)和醚菌酯(均为0.2 μg/kg),其他8种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂均未检出。结果表明,本方法适用于土壤中11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的检测。

3 结论

本研究建立了同时测定不同植被土壤中11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法。该方法简便快速、重现性好、灵敏度高、线性关系良好,适用于不同类型土壤中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的分析。