张爱芝, 李湘江, 王志强, 张书芬, 宋 悦, 曹丽丽, 蔡君美, 陈林吉

(宁波市食品检验检测研究院, 浙江 宁波 315048)

2017年7月20日,比利时通过欧盟食品饲料类快速预警系统(RASFF)通报鸡蛋中检出氟虫腈,截至2017年8月14日,问题鸡蛋波及20个国家和地区,被称为“毒鸡蛋”事件,引起公众广泛关注。氟虫腈(fipronil)又名锐劲特(Regent),是一种苯基吡唑类杀虫剂,对蚜虫、叶蝉、飞虱、鳞翅目幼虫、蝇类和鞘翅目等一系列害虫均具有很高的杀虫活性。研究表明,氟虫腈对蜜蜂及水产动物具有极高毒性[1],国际食品法典委员会(CAC)[2]和日本肯定列表[3]、美国相关标准[4]、欧盟相关标准[5]中规定氟虫腈在蛋中的最大残留限量分别为0.02、0.03和0.005 mg/kg。我国于2009年10月1日开始对该农药限用,GB 2763-2016中明确了氟虫腈及其代谢物在谷物、油料、油脂、蔬菜、水果、糖类和食用菌中的限量(玉米及鲜食玉米为0.1 mg/kg,其他为0.02 mg/kg),但未明确在蛋类中的限量。氟虫腈常见的代谢物有氟甲腈(fipronil desulfinyl)、氟虫腈砜(fipronil sulfone)、氟虫腈硫醚(fipronil sulfide),其代谢路径见图1。

我国标准体系中氟虫腈的检测方法多为气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),在国家标准GB 2763-2016中指定氟虫腈的检测方法为气相色谱-质谱法,具体参照SN/T 1982和NY/T 1379。NY/T 1379标准方法的检出限较高(0.01 mg/kg),无法满足欧盟限量要求;SN/T 1982标准方法的检出限(0. 002 mg/kg)可满足要求,但需使用负化学源,普及率不高。其他涉及氟虫腈的标准检测方法有SN/T 4039-2014、GB 23200.8-2016、GB 23200.9-2016、GB 23200.7-2016等,但这些方法均未检测氟虫腈代谢物,且检测基质均未包含鸡蛋,实际上并不满足GB 2763-2016的规定。

文献[6,7]报道的氟虫腈检测方法的研究对象主要为蔬菜和水果,Zhang等[8]采用固相萃取小柱净化的前处理方法建立了鸡肉及鸡蛋中氟虫腈的检测方法。“毒鸡蛋”事件爆出后,建立鸡蛋中氟虫腈及其代谢物的检测方法成为热点。沈伟健等[9]采用乙腈提取,结合QuEChERS净化技术,建立了GC-MS测定禽蛋及其制品中氟虫腈及其代谢物的方法;郭德华等[10]采用酸性乙腈提取,PRiME HLB SPE柱净化,建立了液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(LC-QTOF MS)快速筛查禽蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢物的方法;励炯等[11]采用酸性乙腈提取,建立了QuEChERS-LC-MS/MS测定禽蛋中氟虫腈及其代谢物的检测方法。

本文通过乙腈提取、NaCl盐析、稀释后直接过膜上机的简单前处理操作,建立了鸡蛋中超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)快速测定氟虫腈及其代谢物的方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及材料

UPLC I-Class Xevo TQ-XS超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司); KS-300EI超声波清洗器(宁波海曙超声仪器公司); TGL-20M高速台式冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司); Vortex 3自动漩涡混合器(德国IKA公司)。

标准品:氟虫腈(1 000 mg/L)和氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫醚(100 mg/L)均购自农业部环境保护科研监测中心,纯度均>98% 。甲醇、乙腈均为色谱纯,购自德国Merck公司;乙酸、氯化钠均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;实验用水为超纯水器(美国Millipore公司)制备的超纯水,电阻率为18.2 MΩ5cm。

1.2 标准溶液的配制

将氟虫腈及其代谢物用甲醇配制成质量浓度为1 mg/L的混合标准储备液,于-18 ℃冰箱中保存;用乙腈-水(50∶50, v/v)配制成质量浓度为0.01、0.05、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg/L的混合标准工作液,待用。

1.3 样品前处理

称取2 g已混匀的生鸡蛋样品,置于塑料离心管中,加入2 mL水和4 mL乙腈,超声提取10 min,加入1 g NaCl,振荡混匀,于4 ℃以9 000 r/min离心10 min,取上清液0.5 mL,加入0.5 mL水,过有机滤膜,待上机分析。

1.4 色谱-质谱条件

色谱柱:Waters ACQUITYTMUPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱温:40 ℃;样品室温度:15 ℃;流速:0.4 mL/min;流动相:A为水,B为乙腈。梯度洗脱程序:0～1.50 min, 90%A; 1.50～3.50 min, 90%A～10%A; 3.50～5.00 min, 10%A; 5.00～5.01 min, 10%A～90%A; 5.01～7.00 min, 90%A。进样体积:3 μL。

离子源:电喷雾电离(ESI)源,负离子模式;离子源温度:150 ℃;毛细管电压:1.08 kV;锥孔电压:25 V;射频透镜1(RF lens)和射频透镜2电压:15.0 V;脱溶剂温度:600 ℃;脱溶剂气流量:1 000 L/h;锥孔反吹气流量:150 L/h;扫描模式:MRM监测模式。氟虫腈及其代谢物的采集参数见表1。

表 1 氟虫腈及其代谢物的保留时间及质谱参数Table 1 Retention time and MS parameters of fipronil and its metabolites

* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

QuEChERS方法多用于水果、蔬菜中农药残留检测的前处理,其技术核心是在水果、蔬菜的提取液中加入除水剂和杂质吸附剂,经离心后直接进行仪器分析,方法简单、快速、高效。本文参照QuEChERS方法，重点考察了样品前处理的条件。

2.1.1加水量的选择

BS-EN-15662标准[12]中采用QuEChERS方法作为蔬菜和水果中农药残留检测的前处理方法,对于含水量小于80%的蔬菜和水果样品,在加入提取剂之前应先加入适量水,以保证提取效果。这可能是因为水的加入可以使乙腈更好地浸入样品内部,从而提高提取效率。鸡蛋含水量较少,本文详细研究了水的加入量对提取效率的影响(见图2)。结果表明,在2 g鸡蛋中加入2 mL水,提取效果最好,故选为实验所用。

图 2 加水量对目标化合物回收率的影响Fig. 2 Effect of the volume of water on the recoveries of the target compounds

图 3 不同提取剂对目标化合物回收率的影响Fig. 3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the target compounds

2.1.2提取剂的选择

农药提取剂主要有乙腈、甲醇、酸化乙腈和甲醇等。采用阴性样品加标的方式分别比较了甲醇、1%(v/v)乙酸甲醇、乙腈、1%(v/v)乙酸乙腈的提取效果(见图3)。结果显示,以甲醇和1%(v/v)乙酸甲醇为提取剂时,提取液浑浊且回收率只有30% ，可能原因是甲醇提取液含杂质较多,基质效应严重；以乙腈为提取剂时,提取液清澈干净,提取效率较高,可能是因为氟虫腈及其代谢物均含有-CN类基团,依据相似相容原理其更易被乙腈提取。在乙腈中引入1%(v/v)乙酸可保证部分农药的稳定性[12],但氟虫腈在中性条件下较稳定[13],因而不受影响。因此实验最终选择乙腈为提取剂。

2.1.3提取剂用量的选择

称取2 g样品,加入2 mL水后,考察提取剂用量对提取效率的影响(见图4)。结果表明,采用4 mL和6 mL乙腈时提取效率均较高,但采用6 mL乙腈时氟甲腈及氟虫腈硫醚的回收率偏高。因此选用4 mL乙腈进行提取。

图 4 提取剂用量对目标化合物回收率的影响Fig. 4 Effect of the amount of extraction solvents on the recoveries of the target compounds

2.1.4NaCl加入顺序及加入量的选择

在乙腈提取前加入NaCl,目标化合物的回收率较低,可能是因为NaCl水溶液与乙腈互溶性较差,乙腈不能很好地进入鸡蛋溶液内部;在乙腈提取后加入NaCl,提取效果较好。NaCl的加入不仅能使有机相和水相充分分离,还能调节有机相的离子浓度,从而提高提取效率。

NaCl在水中的溶解度是20 g, NY/T 761-2008标准规定在农药残留检测时需加入饱和氯化钠溶液以保证提取效果。因此在加入2 mL水的鸡蛋样品溶液中加入1 g NaCl,使NaCl达到饱和状态。

2.1.5离心温度的选择

在常温条件下离心提取液,效果不理想,上清液较少。林涛等[6]尝试冷冻提取鲜枣中的氟虫腈,提取效果较好。这是因为温度的降低会加速水相和乙腈相的分离,促使目标化合物向有机相转移,从而提高提取效率。本实验在4 ℃条件下离心,可获得满意的效果。

2.2 色谱-质谱条件的优化

2.2.1质谱条件的优化

氟虫腈及其代谢物为苯基吡唑类化合物,其结构式中含有-CF3,为缺电子结构,因而适合采用负离子采集模式。在流动相体系下,采用质谱直接连续进样的模式进行质谱条件的优化,确定了目标化合物的锥孔电压、碰撞电压、离子源温度、去溶剂气温度及流量、碰撞气流量及定性定量离子等质谱参数,使每种目标化合物的离子化效率达到最佳,获得的最优质谱条件见表1。

2.2.2色谱条件的优化

实验采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)对氟虫腈及其代谢物进行分离,通过调节流动相梯度,取得了较好的分离效果,4种目标化合物在7 min内即可完成有效分离。

流动相的组成不仅会影响目标化合物的保留时间和峰形,还会影响目标化合物的离子化效率,从而影响灵敏度。因目标化合物在负离子模式下采集,且氟虫腈及其代谢物在中性条件下稳定,因而没有考虑将酸引入到流动相体系中。实验考察了甲醇-水、乙腈-水两种流动相体系在不同梯度洗脱程序下对目标化合物在分离度、峰形、灵敏度等方面的影响。结果显示,乙腈-水作为流动相时无论从基线噪音、柱压还是响应方面均优于甲醇-水体系,且采用的提取剂为乙腈,因而选用乙腈-水作为流动相。

采用优化的实验方法,分别分析了阴性鸡蛋样品和阴性加标鸡蛋样品(见图5)。可以看出,目标化合物在实际样品测定中不受样品基质的干扰。

图 5 阴性鸡蛋样品和加标鸡蛋样品(5 μg/kg)中氟虫腈及其代谢物的色谱图Fig. 5 Chromatograms of fipronil and its metabolites in a negative sample and a spiked sample (5 μg/kg)

2.3 基质效应的考察

基质效应是残留检测中普遍存在的现象,本实验通过基质匹配标准溶液与溶剂匹配标准溶液的响应强度之比进行基质效应的考察。仪器分析方面消除基质干扰的方法主要有采用基质匹配校准曲线、内标法校准、优化梯度洗脱程序、稀释上机液及减小进样体积等。采用基质匹配校准曲线是消除基质干扰的常用方法,但实际检测中存在一定困难;内标法尤其是同位素内标法是最受欢迎的消除基质效应的方法,但很多同位素内标价格昂贵且难以采购。因此本文重点考察了优化梯度洗脱程序、稀释上机液及减小进样体积在减弱或消除基质效应方面的作用。

2.3.1梯度洗脱程序的优化

因本实验采用的是含高压二元泵的超高效液相色谱仪,且所用色谱柱粒径较小,对标准品进行分离时,通过调节洗脱梯度,氟虫腈及其代谢物均可在1.5～3.0 min内出峰且峰形良好,但分析阴性加标样品时发现目标化合物离子丰度比与标准品存在偏差,因而以阴性加标样品进行分离,调节梯度洗脱程序,控制其在3.0～5.0 min时间段出峰,可减少基质干扰,且阴性加标样品中目标化合物离子丰度比与标准品基本无差异。

2.3.2稀释上机液及减小进样体积

稀释上机液是减小基质效应的一种有效方式[14],将加标样品进行稀释,若目标化合物的响应与稀释前相比成比例减小,则基本不存在基质效应,若明显偏大则存在基质抑制效应,明显偏小则存在基质增强效应。本文采用乙腈提取,NaCl盐析后氟虫腈及其代谢物保留在乙腈层中,若直接上机不仅基质效应严重且存在一定的溶剂效应。采用加入同体积的水进行稀释,在消除部分基质效应的同时也可消除溶剂效应,并且水的加入使有机类物质的溶解度有所降低,也可起到部分净化作用。

进样体积的减小也是消除基质效应的一种方式,李红娥[15]发现减小进样体积对部分农药基质效应的消除有较好效果。实验考察了不同进样体积对消除基质效应的影响,发现稀释一倍、进样体积为3 μL时基质效应基本消除,具体数据见表2。

表 2 稀释和进样体积对氟虫腈及其代谢物基质效应的影响Table 2 Influence of dilution and injection volume on the matrix effects of fipronil and its metabolitesAnalyteMatrix effects/%10 μL(dilution)10 μL(without dilution)3 μL(dilution)Fipronil107.8102.5103.4Fipronil desulfinyl115.9105.0103.0Fipronil sulfide123.5111.297.1Fipronil sulfone114.596.397.8

2.4 线性方程、相关系数和检出限

为确认方法是否切实可行,本文参照GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》标准进行了方法学验证。

对1.2节配制的系列混合标准工作液进行分析,以氟虫腈及其代谢物峰面积(y)为纵坐标、对应的质量浓度(x, μg/L)为横坐标，采用外标法绘制标准曲线,氟虫腈及其代谢物在0.01～100 μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)均大于0.999(见表3)。向阴性样品中逐级添加不同水平的混合标准工作液,将在较低水平下目标化合物峰形较好且S/N=3时的含量作为检出限。结果表明,氟虫腈及其代谢物的检出限为0.10～0.43 μg/kg,完全满足欧盟限量要求。

表 3 氟虫腈及其代谢物的线性范围、线性方程、相关系数和检出限Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LODs of fipronil and its metabolites

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 回收率及精密度

对阴性样品进行3个水平(具体参照GB/T 27404-2008)的加标回收试验。结果表明,在3个加标水平下,氟虫腈及其代谢物的平均回收率为77.4% ～112.1% ,精密度为4.0% ～13.6%(n=6),具体数据见表4。

表 4 鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢产物的加标回收率和 精密度(n=6)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of fipronil and its metabolites in eggs (n=6)

2.6 实际样品检测

利用本文建立的方法对宁波市市售的20批鸡蛋样品进行检测,包括养殖鸡蛋和土鸡蛋。结果表明,两批土鸡蛋样品中检出少量氟虫腈砜残留,含量分别为2.89 μg/kg和0.60 μg/kg,存在一定的安全风险。

3 结论

本文采用乙腈提取、NaCl盐析的方法对鸡蛋样品进行前处理,建立了鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢物的超高效液相色谱-串联质谱的测定方法。该法简单、高效、灵敏,所用有机溶剂少,完全满足欧盟及其他国家对氟虫腈的限量要求,可用于实际样品检测。