刘滨，殷学伟，郭励劼，丁红燕，毕宏生，郭大东,*

1. 山东中医药大学第二临床医学院，济南 250014 2. 青岛农业大学生命科学学院，青岛266109 3. 淮阴工学院，江苏省介入医疗器械研究重点实验室，淮安 223003 4. 山东中医药大学眼科研究所，济南 250002

目前，随着纳米技术的发展，越来越多的纳米材料已在基因转染[1-2]、疾病诊断[3-4]、药物传输[5-6]等生物医学领域被广泛应用。由于缺乏系统评估，纳米材料对生物体的风险及对人类身体健康的潜在影响仍然是一个值得关注的问题。

最近，研究人员发现ZnO纳米材料能对生物发挥潜在的遗传毒性[7-9]。ZnO纳米粒子释放到水生生态系统中，能够通过当地和工业废水对鱼类和其他生物产生有害的影响[10]，其遗传毒性与ROS水平升高[11]、钙稳态的失衡[12]、相关信号转导通路如丝裂原活化蛋白激酶信号通路[13]、caspase依赖的信号通路[14]等的激活有关。然而，ZnO纳米粒子引起细胞毒性的作用机制仍不十分清楚。

线粒体是细胞内一种重要的细胞器，在电子传递、线粒体跨膜电位、氧化磷酸化以及ROS的产生和清除[15]等活动中起重要的作用。过量的ROS会促进细胞色素C的释放、引起caspase激活，进而引起细胞损伤或细胞死亡[16]。ATP依赖的Na+/K+-ATP酶可通过ATP水解提供能量，保持细胞内外Na+和K+梯度，对维持细胞膜电位和正常细胞的生理功能具有重要作用[17-18]。其中，由atp1a1基因编码的Na+/K+-ATP酶亚型被认为在所有细胞中均表达[19-21]，由atp1b2基因编码的Na+/K+-ATP酶亚型主要表达于不同的神经细胞以及视网膜光感受器细胞[22-23]。通过Na+/K+-ATP酶调节Na+和K+梯度对维持膜电位和细胞电兴奋性至关重要[18, 24]，Na+/K+- ATPase的功能障碍会导致细胞离子梯度的丧失，导致细胞损伤甚至死亡。

研究证实，视网膜在感光终端区具有较高水平的锌离子，并对调节谷氨酸释放、维持光感受器细胞功能发挥作用[25]。细胞毒作用研究表明，ZnO纳米粒子能破坏正常的细胞[26]，如人晶状体上皮细胞[27]、肺上皮细胞[28]、视网膜神经节细胞[14]和小鼠感光细胞的生理功能，其机制与钙离子(Ca2+)、自噬、凋亡、转化生长因子(TGF-β)和基质金属蛋白酶(MMP)等信号转导通路有关。我们前期研究发现，通过降低TGF-β和MMP-9的表达，ZnO纳米粒子可以抑制小鼠视网膜感光细胞的增殖和迁移[26]，并可抑制超氧化物歧化酶(MnSOD)的表达和活性[29]。在本研究中，我们进一步观察了ZnO纳米粒子对661W细胞的细胞毒作用，探讨其对小鼠光感受器细胞的LDH、Δφm、ROS水平、钾离子通道以及Na+/K+-ATP酶的表达及其活性影响，有助于理解ZnO纳米粒子引起细胞毒作用的相关作用机制。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 ZnO纳米粒子及其溶液的制备

ZnO纳米粒子购自上海谱振生物科技有限公司，纯度大于99.7%；661W细胞由美国俄克拉荷马大学健康卫生中心Muayyad教授惠赠。ZnO纳米粒子经场发射扫描电子显微镜进行表征，其粒径分布范围为15到50 nm，平均粒径为30 nm[30]。

1.2 细胞培养

661W细胞培养在DMEM培养基(DMEM，Life Technology，美国)中，并添加1 g·L-1的葡萄糖，10%胎牛血清(Hyclone公司，美国)，100 μg·mL-1链霉素和100 U·mL-1青霉素，并培养在37 ℃、5% CO2培养箱中；实验过程中由自动细胞计数仪进行细胞计数(TC10，Bio-Rad公司，美国)。

1.3 LDH释放检测

使用LDH细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，上海)检测了ZnO纳米粒子与661W细胞共培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中LDH的释放水平。661W细胞(5×105细胞/孔)接种于6孔板中在37 ℃包含孵化器5%的CO2培养箱培养过夜，然后细胞与不同浓度的ZnO纳米粒子(分别为0、31.25、62.5和125 μmol·L-1)共培养24 h，然后取不同处理条件下的细胞上清培养基120 μL用于LDH细胞毒性检测。检测试剂盒在室温下反应30 min。以不含ZnO纳米粒子培养的661W细胞上清液作为阴性对照。所有的实验操作程序都按照试剂供应商的操作说明进行。

1.4 细胞内ROS水平的测定

通过流式细胞仪(Accuri C6，美国)并使用2，7′- dichlorofluorescin二乙酸(DCFH-DA，Invitrogen公司，美国)测定细胞内ROS的水平变化。小鼠光感受器细胞(5×105细胞/孔)接种于6孔板中，培养过夜，然后用0、31.25、62.5和125 μmol·L-1的ZnO纳米粒子分别共培养6 h。收获细胞并用冷PBS溶液洗涤2次后，细胞用DCFH-DA溶液(10 μmol·L-1)悬浮，然后在黑暗条件下继续培养30 min，再用PBS漂洗，漂洗结束后30 min内用流式细胞仪分析。在每个样品的检测中，收集2×104细胞进行检测计数分析。

1.5 线粒体膜电位分析

Δφm是维持细胞正常的生理条件所必需的。通常用5,5'，6,6'- tetrachloro-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑基碳菁碘(JC-1)在细胞线粒体中积累总量(其荧光红色)以及在细胞质中的单体(其荧光绿色)变化进行检测。细胞凋亡早期的Δφm下降或消失，JC-1不能积聚在线粒体并消散为JC-1单体导致红色荧光的消失[18]。因此，红色荧光响应线性增加膜电位[31]。在本研究中，利用JC-1探针检测细胞内Δφm的水平变化(碧云天生物技术研究所，南通)。661W细胞(5×104细胞/孔)接种于6孔板中，培养过夜后，分别用0、31.25、62.5和125 μmol·L-1的ZnO纳米粒子孵育6 h。然后0.25%胰蛋白酶消化后，收集细胞，PBS洗2次，再用JC-1探针溶液孵育(37 ℃)30 min，在黑暗条件下，用冷PBS洗涤2次，最后，通过流式细胞仪测定Δφm(BDVerse，BD Biosciences公司，美国)。

1.6 全细胞膜膜片钳测定

电压依赖性钾离子(K+)通道(Kv)可以使钾离子穿过细胞膜引起膜电压的变化，并通过调节动作电位的形状和频率调节靶细胞的兴奋性，从而具有生理和病理生理的影响[32]。本研究中，我们利用port-a-patch Nanion芯片系统(epc-10，Heka，Nanion，德国)在室温(25 ℃)条件下进行全自动膜片钳实验。膜片钳实验前将661W细胞培养在6孔板。实验时用PBS冲洗细胞，分离暴露在0.25%含1 mmol·L-1EDTA的胰蛋白酶中。用不同浓度(即0、31.25、62.5和125 μmol·L-1)ZnO纳米粒子培养5 min后，用细胞膜片钳测定延迟整流钾电流的变化情况。用电解质溶液有以下成分：细胞外液含10 mmol·L-1NaCl, 75 mmol·L-1CsCl, 2 mmol·L-1MgCl2, 70 mmol·L-1CsF, 10 mmol·L-1Hepes/KOH, pH 7.2；细胞内液含10 mmol·L-1KCl, 75 mmol·L-1NaCl, 70 mmol·L-1NaF, 2 mmol·L-1MgCl2, 2 mmol·L-1CaCl2, 5 mmol·L-1D-glucose monohydrate, 2 mmol·L-1EGTA, 10 mmol·L-1Hepes/NaOH, pH 7.4。去极化电位为+40 mV的-80 mV的钳制电位测定的延迟整流钾电流。patchmaster软件(Nanion，德国)用来记录延迟整流钾电流。

1.7 Na+/K+-ATP酶mRNA表达水平分析

661W细胞(2×105细胞/孔)接种于6孔板，培养过夜后采用不同浓度(分别为0、31.25、62.50和125 μmol·L-1)ZnO纳米粒子孵育661W细胞2 h，经胰蛋白酶消化收集细胞并提取细胞总RNA，然后根据试剂盒的操作步骤，用Trizol试剂提取细胞661W的总RNA(艾德莱生物科技有限公司，北京)。首先用600 ng总RNA合成单链cDNA，然后以逆转录得到的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR分析。引物序列见表1，Q-PCR程序设置如下：95 ℃ 5 min，其次是95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环。实验结果用各自的内源GAPDH控制后使用2ΔΔCT方法进行归一法处理[33]。

表1 PCR扩增目标基因的引物Table 1 Primers in amplification of target genes by quantitative PCR

图1 ZnO纳米粒子对细胞形态和661W细胞释放LDH的影响注：*P<0.05, **P<0.01，与对照比较。Fig. 1 Effects of ZnO nanoparticles on cell morphology and LDH release in 661W cellsNote: Scale bar = 20 μm；*P<0.05, **P<0.01, compared with control.

图2 流式细胞仪检测细胞和不同浓度的ZnO 纳米粒子共培养24 h后ROS水平注：*P<0.05, **P<0.01，与对照比较。Fig. 2 ROS levels of 661W cells after exposure to different concentrations of ZnO nanoparticles for 24 hNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

1.8 细胞内Na+/ K+-ATP酶表达和活性分析

661W细胞(4×105细胞/孔)接种于6孔培养板中于37 ℃、CO2培养箱里过夜，后弃去上清液，再使用不同浓度(分别为0、31.25、62.50和125 μmol·L-1)的ZnO纳米粒子继续培养6 h，然后用0.25%含1% EDTA的胰蛋白酶溶液消化收集细胞、离心，用冷PBS悬浮细胞团洗涤细胞2次。再用0.5 mL冷PBS悬浮细胞团，在冰上超声处理10 min后5 000 g离心10 min，收集上清溶液，进行蛋白定量，然后用ELISA试剂盒检测100 μL上清中小鼠Na+/ K+-ATP酶的蛋白水平含量。实验方法按照试剂盒供应商的实验方案进行(武汉基因美生物科技有限公司，武汉)。此外，Na+/K+-ATP酶活性(每个样品为50 μL)使用Na+/K+-ATP酶活性检测试剂盒进行测定(南京建成生物工程研究所)。使用紫外可见双光束分光光度计(4802S UV/VIS，尤尼科(上海)有限公司)在636 nm处测定吸光度值，每个实验重复3次。

1.9 统计学分析

数据用至少3个独立实验的平均值±SD(标准偏差)表示。统计学分析采用One-way ANOVA的Newman-Keuls检验，P<0.05有统计学意义。

2 结果(Results)

2.1 LDH释放度的测定

图1显示小鼠光感受器细胞在与不同浓度的ZnO纳米粒子培养24 h后实验组与阴性对照样品(即细胞培养于不含ZnO纳米粒子的溶液中)细胞形态和LDH释放曲线。图中看出，661W细胞暴露于ZnO纳米粒子溶液24 h导致LDH释放到培养基中的水平明显升高，并且LDH在培养基中的释放水平增加与细胞中ZnO纳米粒子的培养浓度密切相关。

2.2 细胞内ROS水平的测定

661W细胞分别于0、31.25、62.5和125 μmol·L-1的ZnO纳米粒子共培养6 h后，ROS的产生从1.8%±0.35%分别上升到31.7%±2.74%, 43.8%±2.97%和61.5%±5.36%(图2)。随着细胞培养基中ZnO纳米粒子浓度的增加，ZnO纳米粒子诱导的ROS水平也随之升高，表明ROS的产生依赖于细胞中ZnO纳米粒子的培养浓度。此外，ZnO纳米粒子诱导产生的ROS与对照样品产生的ROS相比，有显著的统计学差异(P<0.05)。

2.3 线粒体膜电位的改变

ZnO纳米粒子溶液与661W细胞共培养6 h后，红色荧光强度明显下降。如图3所示，经31.25、62.50和125 μmol·L-1的ZnO纳米粒子溶液处理细胞6 h后，小鼠光感受器细胞的Δφm从94.6%±1.2%分别下降到83.5%±1.6%, 75.1%±2.3% 和 64.3%±1.7%，证实ZnO纳米粒子溶液处理可对661W细胞的Δφm产生明显下调作用。

2.4 延迟整流外向钾电流的抑制作用

如图4所示，小鼠光感受器细胞具有较大的延迟整流外向钾电流。然而，在细胞经不同浓度的ZnO纳米粒子处理后，细胞的延迟整流钾电流均表现出下降趋势，并且呈浓度依赖性，即越高的ZnO纳米粒子与靶细胞共培养，则会导致延迟整流钾电流越小。

2.5 Na+ / K+-ATP酶表达水平的下降

用不同浓度的ZnO纳米粒子培养661W细胞后，我们分别用实时荧光定量PCR以及ELISA对细胞内Na+/K+-ATP酶的mRNA和蛋白水平进行了检测。图5A显示在经31.25、62.50和125 μmol·L-1的ZnO纳米粒子溶液培养细胞后，细胞内Na+/K+-ATP酶Atp1a1 的mRNA水平下降到正常对照组细胞水平的45.7%、 62.5% 和 33.6%，同时Atp1b2的mRNA水平下降到正常对照水平的19.2%、31.9% 和26.8%，对照组与处理组的mRNA表达水平有明显的统计学差异。

利用ELISA方法，我们还检测了661W细胞内Na+/K+-ATP酶与不同浓度的ZnO纳米粒子共培养6 h后蛋白质水平的变化。图5B显示了细胞暴露于不同浓度的ZnO纳米粒子后Na+/K+-ATP酶的表达水平变化情况。我们观察到小鼠光感受器细胞内Na+/K+-ATP酶的蛋白水平从15.03 pg·mg-1分别降低到11.88、10.77和9.81 pg·mg-1，并具有浓度依赖性。

图3 不同浓度的ZnO纳米粒子处理6 h后661W细胞Δφm变化注：*P<0.05, **P<0.01，与对照比较。Fig. 3 Alterations of Δψm in murine photoreceptor cells after treatment with different concentrations of ZnO nanoparticles for 6 hNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

2.6 Na+ / K+-ATP酶活性降低

细胞经31.25、62.50和125 μmol·L-1的ZnO纳米粒子溶液处理后，Na+/K+-ATP酶的活性与未经处理的661W细胞Na+/K+-ATP酶的活性相比均有明显的下降。如图6所示，ZnO纳米粒子处理可显著降低Na+/K+-ATP酶的活性。我们发现Na+/K+-ATP酶活性从0.428下降到0.302、0.344和0.324 U ·mg-1，证实ZnO纳米粒子溶液的处理可显著抑制Na+/K+-ATP酶的活性。

3 讨论(Discussion)

研究表明，ZnO纳米粒子具有明显的细胞毒作用，其作用机制与氧化应激有关[11]。Fu等[32]发现，工程纳米材料因其尺寸小、高比表面积和高表面反应性可产生更高水平的ROS并诱导氧化损伤。暴露于ZnO纳米粒子的661W细胞可能会导致细胞产生过量的ROS(图2)。Yoo等[34]研究发现，Hela细胞可通过吸附和细胞内吞作用将带正电荷的ZnO纳米粒子吸入到细胞内部，进一步诱导细胞死亡并产生过多的ROS，这表明ZnO纳米粒子对ROS的产生具有强烈的诱导作用。因此，ROS的过度产生会引发内质网应激作用而造成细胞损伤，最终诱导靶细胞凋亡或坏死。

已证实线粒体功能异常是造成Δφm下降的主要原因，可能会导致线粒体去极化、致凋亡蛋白释放到细胞质中进而参与细胞凋亡[35]。同时，线粒体也是细胞内ROS的主要来源。因此，Δφm和ROS水平的测定对于线粒体功能正常与否提供了参考[36]。在本研究中我们发现，ZnO纳米粒子可导致661W细胞Δφm下降，ZnO纳米粒子溶液浓度越高，线粒体膜电位下降越大(图3)。这一结果表明，线粒体膜电位的下降是细胞经ZnO纳米粒子处理后诱导661W细胞死亡的关键所在。

图5 不同浓度ZnO纳米粒子处理后Na+/K+ -ATP酶的mRNA和蛋白水平表达注：*P<0.05, **P<0.01，与对照比较。Fig. 5 Expressions of Na+/K+-ATPase at mRNA and protein levels after treatment with different concentrations of ZnO nanoparticlesNote: *P<0.05, **P<0.01, conpared with control.

图6 不同浓度的ZnO纳米粒子处理后661W细胞Na+/K+ -ATP酶活性的测定注：*P<0.05, **P<0.01，与对照比较。Fig. 6 Measurement of Na+/K+-ATPase activity of murine photoreceptor cells after treatment with different concentrations of ZnO nanoparticlesNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

电压依赖性钾通道可以使膜电位依赖性K+的选择性渗透，在维持正常的细胞的生理状态发挥关键作用[37]。Zhao等[38]研究发现，采用全细胞膜片钳技术，ZnO纳米粒子能使大鼠海马CA3区锥体神经元整流钾电流从20 mV增加到90 mV。电生理实验结果表明，ZnO纳米粒子能阻断电压依赖性钾通道的离子渗透途径，影响细胞内外钠离子和钾离子的交换，从而使细胞的Δφm下降并破坏细胞内的微环境平衡，最终导致细胞损伤。

Na+/K+-ATP酶对于维持跨膜离子梯度和基本的细胞功能及存活至关重要。本文研究发现，细胞暴露于ZnO纳米粒子可引起LDH水平升高和ROS水平增加，导致细胞内氧化应激的发生。如果细胞内过度氧化应激不能及时排除，这将抑制Na+/K+-ATP酶的表达和活性，扰乱细胞内外离子之间的Na+和K+的交换以及阻断延迟整流钾电流和膜电位的平衡，引起细胞损伤。Sawosz等[39]发现在鸡胚胎发育的初期注射纳米银为可以增加Na+/K+-ATP酶的表达，影响细胞分化；同时，Bessemer等[40]还透露，淡水鱼暴露在ZnO纳米粒子可以增加鳃的Na+/K+ATPase活性，这结果可能是归因于上皮通透性增加或结构重塑。基于上述研究结果，我们推断，暴露于纳米粒子后的Na+/K+-ATP酶活性的差异可以解释为暴露于ZnO纳米粒子的组织和纳米材料的变化。

总之，ZnO纳米粒子能明显促进细胞内LDH释放到培养基中，提高细胞内ROS的水平，破坏661W细胞的Δφm。小鼠感光感受器细胞暴露于ZnO纳米粒子会降低延迟整流钾电流和抑制Na+/K+-ATP酶的表达及其活性，从而破坏细胞内微环境的平衡，诱发细胞死亡，最终表现出ZnO纳米粒子对661W细胞的毒性作用。我们的研究结果有助于阐释ZnO纳米粒子介导的钾离子通道阻滞和Na+/K+-ATP酶抑制引起的小鼠光感受器细胞生长抑制和细胞毒作用。

致谢：本研究得到了江苏省介入医疗器械重点实验室开放基金项目(jr1602)和山东省医药卫生科技发展计划(2013WS0251)的资助，在此表示感谢。