閤静，赵云，黄佳伟，张萍，潘雯，尤安琪，黄希，杨旭，李睿

华中师范大学生命科学学院，武汉 430079

2016年，世界卫生组织发布报告指出，世界上92%的人口生活在空气质量水平超过世界卫生组织限值的地区[1]。在我国，当前最为关注的城市室外和室内空气污染物分别是PM2.5和甲醛[2-3]。

大气PM2.5，指空气动力学等效直径≤2.5 μm的细颗粒物，是我国近年来对人体健康影响最大的空气污染物。吸附了不同污染物的PM2.5被吸入到肺组织后，可通过微血管扩散到血液中，引起肺癌、呼吸道疾病、心血管疾病[4-5]，以及免疫系统和造血系统疾病等健康问题[6-7]。谢元博等[8]发现，PM2.5每增加10 μg·m-3，北京市健康居民哮喘发病率增加2.10%。另外，2016年《环境卫生展望》(EnvironmentalHealthPerspectives，EHP)杂志上的一文指出，PM2.5浓度增加量即使低至4.00～7.06 μg·m-3，都与健康人群哮喘的患病率上升相关[9]。上述研究表明，室外大气PM2.5与哮喘发病率相关，其暴露可引起肺组织损伤。

甲醛作为一种重要的化工原料，广泛应用于建筑、木材加工、家具、纺织品等产业。它对人体健康的负面影响涉及多个组织器官，主要表现为眼部和呼吸道的刺激作用，呼吸道紊乱、哮喘或类似哮喘的病症，长期接触甲醛还可导致鼻腔、鼻咽、消化道和皮肤的癌变，以及白血病等造血系统恶性肿瘤[10]。岳伟等[11]在甲醛暴露和成人哮喘关系的病例对照研究中指出，甲醛浓度超过0.12 mg·m-3后，室内甲醛每升高10 μg·m-3，健康成人哮喘危险性提高0.2倍。澳大利亚Rumchev等[12]研究发现，甲醛暴露水平达到或超过0.60 mg·m-3时，健康儿童发生哮喘的危险度就会增加。上述2项研究表明，甲醛暴露可以诱导健康成人和儿童发生哮喘，且儿童的对甲醛的敏感性更高。

目前，无论流行病学或是实验研究，都主要关注室外大气PM2.5和甲醛的单独暴露效应，二者联合暴露效应在环境学界的研究迄今为止鲜有报道。2016年中国环境状况公报数据显示，2016年80%城市PM2.5浓度超过我国环保部的安全标准35 μg·m-3[3]。此外，目前我国城市室内甲醛超标居室比例高达70%[13]。基于PM2.5和甲醛超标污染的客观情况，二者复合暴露更接近于我国城市居民的真实生活环境。因此，研究二者联合暴露的健康效应非常必要。本项研究中，通过肺组织病理学观察、氧化应激、DNA损伤及细胞凋亡等生物学指标的检测，从而探讨PM2.5和甲醛单一及复合暴露诱导产生小鼠肺损伤的可能机制。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验动物

SPF级6周龄雄性Balb/c小鼠(约22 g)购自湖北省疾病预防控制中心。购买回来后在动物饲养室继续饲养1周，待其适应新环境后再进行实验。动物饲养室的环境条件为：温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%，光暗循环周期为12 h:12 h。

1.2 主要试剂与仪器

福尔马林(10%，Sigma公司)，PM2.5染毒液(采集于华中师范大学)，AZD8055(Abmole Bioscience公司)，GSH试剂盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠8-OH-dG ELISA试剂盒(Blue Gene)，小鼠Caspase-3 ELISA试剂盒(Blue Gene)，蛋白酶K(Merck)，Hoechst 33258荧光染料(Sigma公司)，小型智能环境气候仓(WH-2)，气态甲醛浓度测定仪(4160-2)，全波长/荧光酶标仪(Bio-tek)，全波长酶标仪(DNM-9602)。

1.3 实验方法

1.3.1 PM2.5样品制备

2015年10月—2016年1月，在华中师范大学建筑物楼顶(高10 m左右，周围没有明显的污染源)放置Thermo Anderson G-2.5大流量釆样器(美国热电子公司)，采用石英纤维滤膜(英国Whatman公司)采集大气PM2.5。采样后将采有PM2.5的滤膜裁剪为长宽均为l cm，浸入去离子水中，超声振荡15 min，重复3次，洗脱PM2.5，振荡液用6层纱布过滤，滤液冷冻真空干燥(Labconco，USA)，低温冰箱保存备用。暴露时，用无菌生理盐水配制成相应浓度悬液。

1.3.2 实验动物分组与暴露方案

实验采用48只SPF级雄性Balb/c小鼠，随机分为6组，每组8只小鼠。FA采用职业气态暴露方式(3 mg·m-3，8 h·d-1，5 d·w-1，2 w)，PM2.5采用气道滴注的暴露方式(2.5 mg·mL-1，40 μL·次-1，3次·w-1，2 w)。介导DNA损伤修复哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)特异性的阻断剂AZD8055采用灌胃的方式进行暴露，暴露的剂量为20 mg·kg-1·d-1。实验动物分组与暴露方案如图1所示。

1.3.3 肺组织匀浆液制备

第12天染毒结束之后，将小鼠颈椎脱臼处死，取小鼠肺组织，称重，加入一定量预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)，用玻璃匀浆器在0～4 ℃下制成10%的组织匀浆液，将匀浆液以10 000 r·min-1离心15 min，取上清备用。

1.3.4 生化指标测定

小鼠肺蛋白含量测定：Folin-酚法测定小鼠肺组织匀浆的蛋白含量，具体实验步骤按照试剂盒说明书标准操作规范进行。ROS含量测定：采用2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)法，取小鼠肺组织匀浆并用PBS稀释100倍。每孔100 μL加入酶标板中。加入10 mmol·L-1的DCFH-DA 100 μL，在37 ℃下避光保存10 min后，在480 nm激发光、520 nm 发射光下测量其荧光强度。GSH含量测定：具体实验步骤按照所使用试剂盒说明书标准操作规范进行。MDA含量测定：采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法。取10 mL试管，每管加入0.5 mL待测样品液，然后各管加入2 mL 6%TBA溶液，混匀后沸水浴15 min，取出后流水冷却。10 000 r·min-1离心10 min，取上清液分别在450 nm、532 nm和600 nm波长下测定吸光值，按C(μmol·L-1) = [6.45 (A532-A600) -0.56A450]/蛋白浓度，计算出每管样品中MDA的浓度。DPC系数测定：采用KCl-SDS沉淀法。向样品中加入100 mmol·L-1KCl可形成十二烷基硫酸钾-蛋白质沉淀联合物，而游离的DNA留在上清液中。将上清转移后，向沉淀加入蛋白酶K消化与DNA交联的蛋白质，使交联的DNA释放出来。再加入荧光染料Hoechst 33258对DNA染色，测定荧光值即可得出DNA的相对含量。最后通过公式来计算DPC系数，DPC=交联DNA含量/(交联DNA含量+游离DNA含量)。8-OH-dG和Caspase-3含量测定：使用双抗体夹心ELISA法测定,具体实验步骤按照所使用试剂盒说明书标准操作规范进行。

图1 实验动物分组与暴露方案Fig. 1 Experimental groups and exposure scheme

1.3.5 小鼠肺组织切片

从气管开始小心剥离完整的肺，之后在预冷的生理盐水中冲洗干净肺表面的血迹，做好标记后浸没于固定液中。48 h后，经脱色、清洗、染色、脱水等处理后用石蜡包埋，切成约10 μm的薄片，制成永久装片。

1.4 统计学分析

实验数据用平均值±标准差表示。用GraphPad Prism 5软件作图，SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，Turkey多重比较(multiple comparisons)检验组间均值的差异显著性，显著水平α定为P<0.05。

2 结果(Results)

2.1 小鼠一般体征和体重的变化

对照组小鼠皮毛干爽光滑，精神状态良好，喜动而不喜卧。染毒2周后，与对照组相比，PM2.5+FA组和PM2.5+FA+AZD8055组小鼠的毛汗湿竖立，精神萎靡，喜挤卧而不喜动。小鼠体重的变化如图2所示，各染毒组小鼠的体重与对照组相比都出现不同程度的降低(P>0.05)。

图2 小鼠体重变化Fig. 2 Body weight change in mice

2.2 小鼠肺组织氧化应激指标测定结果

染毒2周后，小鼠肺组织ROS含量变化如图3A所示，与对照组相比PM2.5组、FA组、PM2.5+FA组以及PM2.5+FA+AZD8055组的ROS水平都显著上升(P<0.001)；分别与PM2.5、FA单独暴露组相比，PM2.5+FA组的ROS含量的增加也具有显著差异(P<0.001)；与PM2.5+FA组相比，PM2.5+FA+AZD8055组的ROS含量显著性增加(P<0.05)。小鼠肺组织GSH含量变化如图3B所示，与对照组相比，各组GSH水平均表现为显著性下降(P<0.01或P<0.001)；相比于PM2.5组，PM2.5+FA组中GSH含量显著性降低(P<0.05)。小鼠肺组织MDA含量变化如图3C所示，与对照组相比，PM2.5组的MDA水平显著性上升(P<0.05)，FA组，PM2.5+FA组和PM2.5+FA+AZD8055组MDA水平显著性上升(P<0.01)；与PM2.5组相比，PM2.5+FA组MDA水平显著性上升(P<0.05)；相比与PM2.5+FA组，PM2.5+FA+AZD8055组MDA水平显著上升(P<0.05)。

2.3 小鼠肺组织DNA损伤测定结果

小鼠肺组织DPC含量变化如图3D所示，与对照组相比，各组DPC水平均显著性上升(P<0.01或P<0.001)。小鼠肺组织8-OH-dG含量变化如图3E所示，与对照组相比，FA组8-OH-dG含量显著上升(P<0.05)；PM2.5组，PM2.5+FA组和PM2.5+FA+AZD8055组8-OH-dG含量显著上升(P<0.01)；与PM2.5、FA单独暴露组相比，PM2.5+FA组8-OH-dG含量显著上升(P<0.01)。

2.4 小鼠肺组织凋亡Caspase-3含量测定结果

图3F显示，相比于对照组，各组Caspase-3含量显著上升(P<0.001)。与PM2.5组、FA组单独暴露组相比，PM2.5+FA组Caspase-3含量显著性(P<0.05)上升。

2.5 肺组织H&E染色

肺组织H&E染色切片镜检结果如图4所示，对照组和AZD8055组小鼠的肺组织切片表现为气道组织上皮结构完整，气道壁光滑，没有明显的细胞浸润，气道平滑肌细胞为单层排列。PM2.5组和FA组小鼠的肺组织切片表现为气道壁增厚，气道皱缩，周围出现以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主的炎细胞浸润。从PM2.5+FA组和PM2.5+FA+AZD8055组可以看出，气道表皮出现了严重的皱缩、断裂，气管周围与肺泡腔出现大量的炎症细胞浸润。

3 讨论(Discussion)

近年来的研究发现，生理水平的ROS可作为信号分子参与细胞增殖、迁移、分化和基因表达等生命过程。当机体受到外界不良因素刺激时，过量生成的ROS可以耗竭体内GSH，造成机体中生物大分子过氧化，其中MDA是脂质过氧化的主要产物之一[14]。持续的氧化应激会导致包括Caspase-3在内的凋亡因子释放，使线粒体功能失调，产生细胞凋亡[15]。本研究中，PM2.5复合甲醛暴露后，小鼠肺组织中ROS和MDA含量出现显著性上升，GSH含量下降，表明PM2.5联合甲醛暴露可以使机体抗氧化能力降低，导致肺组织产生氧化损伤。此外，二者单独暴露均会导致肺组织中Caspase-3含量显著升高，复合暴露可显著提升小鼠肺组织Caspase-3水平。由此推测，PM2.5与甲醛共同作用导致小鼠肺组织产生强烈的氧化应激，从而诱导凋亡因子释放和线粒体功能失调，引发细胞凋亡。

图3 小鼠肺组织氧化应激、 DNA损伤、细胞凋亡测定结果注：与对照相比，* P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与PM2.5+FA组相比，#P<0.05，## P<0.01，### P<0.001。Fig. 3 The oxidative stress, DNA damage, apoptosis levels in the lung tissueNote: Compared with control group, * P<0.05, **P<0.01,***P<0.001; compared with PM2.5+FA group, # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001.

图4 小鼠肺组织切片H&E染色注： A，对照组；B，AZD8055组；C，PM2.5组；D，FA组；E，PM2.5+FA组；F，PM2.5+FA+AZD8055组。黑色箭头为支气管重塑；蓝色箭头为炎症细胞浸润。Fig. 4 Histopathological changes of mouse lung tissue stained with H&ENote: A, Control group; B, AZD8055 group; C, PM2.5 group; D, FA group; E, PM2.5+FA group; F, PM2.5+FA+AZD8055 group. Black arrows indicate bronchial remodeling；blue arrows indicate inflammatory cells infiltration.

此外，过量的ROS还能攻击DNA分子，形成稳定的共价化合物8-OH-dG严重影响DNA分子的构象与功能，阻碍正常的基因的复制与转录翻译过程[16]。体内和体外实验研究均表明，甲醛可以诱导大鼠肺组织DNA生成8-OH-dG，且呈现剂量效应[17]，而Longhin等[18]研究发现，PM2.5暴露会导致8-OH-dG含量的增加。本研究中，PM2.5联合甲醛暴露后，小鼠肺组织8-OH-dG含量增加，由此说明，PM2.5和/或甲醛暴露能通过过量ROS从而引起小鼠产生DNA损伤。DPC是甲醛诱发DNA损伤的主要形式，由DNA和蛋白质共价交联形成。甲醛作为交联剂直接导致与之接触的组织和细胞形成过量DPC，影响了DNA的结构和功能[19-20]。本研究中，PM2.5和甲醛单独暴露均会导致肺组织DPC的形成，且PM2.5和甲醛复合暴露可显著增加DPC的含量。由此推测，可能由于二者共同暴露导致肺组织发生氧化应激，产生大量ROS，继而介导了8-OH-dG和DPC形成，造成严重的DNA损伤效应。

正常情况下，当DNA损伤发生时，机体可启动DNA损伤修复，其中，mTOR可通过mTORC1-S6K1激活范可尼贫血互补群基因D2(Fanconi anemia complementation group D2，FANCD2)，进而激活ATM-Chk2检验点来修复DNA损伤，从而减少DNA分子损伤[22]。Guo等[22]的研究也表明，当小鼠mTOR基因被敲除后，FANCD2蛋白表达下调，进而导致了DNA的损伤，由此说明mTOR参与了DNA损伤的修复。AZD8055作为mTOR分子的特异性抑制剂，能够特异性阻断DNA的损伤修复，从而加重DNA的损伤[23]。本研究中，使用阻断剂AZD8055后可使暴露于PM2.5和甲醛的小鼠体内DPC和8-OH-dG含量显著上升，从而进一步验证了AZD8055能够阻断mTOR介导的DNA损伤修复途径，从而加重DNA的损伤。

综上，本研究表明，PM2.5，甲醛暴露后小鼠肺组织发生病变，肺组织出现氧化损伤、DNA损伤和细胞凋亡的现象，导致了小鼠的肺损伤。PM2.5和甲醛联合暴露会加重小鼠肺损伤，表现为协同作用。而复合暴露导致肺部的氧化损伤，因破坏DNA损伤修复而加重的DNA损伤，以及细胞凋亡可能是联合暴露导致肺损伤的重要机制。PM2.5和甲醛复合暴露肺损伤对解释我国哮喘的发病率居高不下具有一定的提示作用。

致谢：感谢科技部十三五国家重点研发计划(No：2017YFC0702700)和国家自然科学基金(No: 21577045)对本研究的资助。