李景龙，孙玉青，陈保冬，李涛，胡亚军，张莘,*

1. 中国科学院生态环境研究中心 城市与区域生态国家重点实验室，北京 100085 2. 中国科学院大学，北京 100049

砷(arsenic，As)是一种毒性极强的环境污染物和一类致癌物。自然因素及人类活动造成的土壤和水体砷污染已经成为亟待解决的全球性的环境问题[1]。亚洲是受砷污染威胁最严重的地区，越南、印度、孟加拉等国以及我国的湖南、贵州、广东、内蒙古、山西以及台湾等地均受到不同程度的砷污染危害[2-3]。环境中的砷对生物体从表观、生理到遗传方面都有严重的毒害作用，更可以通过饮用水和食物链危及人体健康[4]。

自然土壤和水体中的砷主要以无机五价砷As(V)和无机三价砷As(III) 2种氧化态存在[5]。As(V)主要通过磷转运蛋白进入生物体内，而As(III)通过水通道蛋白被生物吸收[6]。砷吸收进入生物细胞后，会发生一系列砷还原和甲基化的转化过程。As(V)首先在砷酸盐还原酶的作用下被还原成As(III)，生成的As(III)可以被金属硫蛋白、植物络合素等结合固持在液泡中降低其移动性，或者通过特异性的膜转运蛋白将As(III)排出体外，抑或在砷甲基转移酶的作用下将As(III)转化为低毒的甲基砷最后以挥发态排出体外，从而达到砷解毒的目的[7]。因此，将As(V)还原为As(III)是生物砷代谢及解毒过程中的关键环节。砷酸盐还原酶基因在细菌、真菌以及植物中已有广泛报道。希瓦氏菌Shewanellasp. strain ANA-3敲除砷酸盐还原酶基因arrAB后则无法在含As(V)的环境中存活[8]；莱茵衣藻C.reinhardtii能够利用其自身的砷酸盐还原酶基因CrACR2.1和CrACR2.1将培养基中添加的As(V)还原为As(III)并外排到环境中[9]。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是土壤中普遍存在的一类内生真菌，能够与绝大多数陆生植物形成共生关系[10]。AMF在改善植物矿质营养状况，促进植物生长，提高植物对干旱、重金属等逆境胁迫的耐性等方面都发挥了重要作用[11-12]。研究表明，接种AMF能够显著降低植物体内的砷浓度。一方面，AMF通过改善植物磷营养状况，促进植物生长，从而稀释了植物体内过量的砷[13]；另一方面，AMF的侵染能够使植物根系的高亲和磷转运蛋白的表达量下调，抑制植物对As(V)的吸收[14]。此外，Gonzalez-Chavez 等[15]发现，AMF可能同样具有将体内的砷通过As(III)外排系统排出体外的能力。As(III)外排泵ArsAB由ATP酶GiArsA和As(III)透过酶GiArsB组成。环境中的As(V)通过根外菌丝上的高亲和磷转运蛋白GiPT进入真菌菌丝，随后在菌丝内被还原为As(III)，然后在ArsAB的作用下排出体外。Li等[16]研究发现，接种AMF能够显著提高水稻根系As(III)/As(V)的比例；Zhang等[17]在接种AMF的紫花苜蓿体内检测到了更高比例的As(III)，这些结果表明AMF很可能直接参与了As(V)的还原过程。在这一途径中，已鉴定出As(V)转运蛋白基因GiPT和As(III)外排泵ArsAB中的ATP酶基因GiArsA[15]。然而，作为AMF砷代谢的关键步骤，As(V)还原过程的分子机制还未见报道。

本研究从AMF异形根孢囊霉RhizophagusirregularisDAOM 197198中克隆得到了一个砷酸盐还原酶基因RiarsC，并将该基因转入arsC缺陷型大肠杆菌E.coli菌株中。通过对E.coli的砷抗性和砷形态分析，对该基因的功能进行了初步的验证，从分子水平阐释了AMF对As(V)的还原机理，更进一步揭示了AMF增强植物砷耐性的分子机制。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试菌株

AMF异形根孢囊霉RhizophagusirregularisDAOM 197198，由中国科学院生态环境研究中心土壤生态过程与生态重建研究组保藏。利用双重无菌培养体系对R.irregularis进行培养[18]。二分室培养皿分为菌根室和菌丝室，在菌根室中加入30 mL固体M培养基，用0.4% (w/v) phytagel (Sigma-Aldrich，USA) 作为凝固剂；在培养基上接种转发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes) Ri T-DNA质粒的胡萝卜(Daucuscarota)毛状根，并接种R.irregularisDAOM 197198无菌孢子；待毛状根布满菌根室后，在菌丝室加入15 mL液体M培养基；25 ℃黑暗培养8周直至R.irregularis菌丝布满菌丝室，用于RNA的提取。

1.2 RNA提取

取0.05 g新鲜菌丝用TRIZOL试剂(Invitrogen，USA)提取总RNA。用紫外分光光度计(Nano drop 2000，USA)测定RNA的浓度和纯度并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。取2 μg RNA，用逆转录试剂盒PrimeScript®RT Reagent Kit(TAKARA，大连)合成cDNA，具体方法参照试剂说明书。

1.3 丛枝菌根真菌砷酸盐还原酶基因RiarsC的克隆

根据GenBank上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)丛枝菌根真菌异形根孢囊霉R.irregularisDAOM 197198 基因组中预测的砷酸盐还原酶基因(Genbank登录号KI300620.1)设计全长引物RiarsC1F：5′-ATGTCATTTCGACTAAATATGG-3′和RiarsC1R：5′-TCATTCCTTTGTATATCCCAAC-3′。以cDNA为模板，利用高保真酶 KOD-plus(TOYOBO，Japan)进行 PCR 扩增，获得基因全长，将该基因命名为RiarsC。PCR条件为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性15 s，53 ℃退火45 s，68 ℃延伸1 min 20 s，35个循环，72 ℃终延伸1 min。将扩增产物回收，连接pGEM-T Easy克隆载体(Promega，USA)后，转入感受态细胞E.coliJM109(TAKARA，大连)，筛选阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。从阳性菌株中提取质粒，利用引物RiarsC2F：5′-CGCGGATCCATGTCATTTCGACTAAATATGG-3′和RiarsC2R：5′-CCGGAATTCTCATTCCTTTGTATAT CC-3′进行PCR扩增为该基因加入酶切位点BamHI和EcoRI(下划线所示)，PCR条件同上。扩增产物回收后，连接表达载体pET-28a+(Biofeng，上海)并转入砷敏感型E.coliWC3110(DE3)(ΔarsC)中，该菌株敲除了E.coliR773质粒上的砷酸盐还原酶基因arsC，对As(V)的还原能力大大降低[19]。将转入RiarsC的菌株命名为WC3110+RiarsC；同时，将空载体pET-28a+转入E.coliWC3110中作为阴性对照，将该菌株命名为WC3110+pET28a。将菌株WC3110+RiarsC，WC3110+pET28a，WC3110和野生型E.coliW3110这4种菌株转入LB液体培养基中37 ℃、180 r·min-1震荡培养。

1.4 RiarsC序列分析和系统发育树构建

将测序成功的RiarsC扩增片段序列与已知的细菌、真菌砷酸盐还原酶基因序列在NCBI上进行BLAST分析。利用在线软件ExPASy(http://web.expasy.org)对RiArsC蛋白进行氨基酸序列推导及分子量预测。利用MEGA 7.0.14软件，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建氨基酸序列系统发育树。

1.5 As(V)抗性分析

将上述4种菌株在LB培养基中培养8 h后，取1 mL菌悬液分别加入到100 mL新鲜的LB培养基中。LB培养基中加入0.3 mmol·L-1IPTG，50 mg·L-1卡那霉素(WC3110和W3110除外)以及2种浓度的Na3AsO4·12H2O(50 μmol·L-1and 100 μmol·L-1；分析纯，国药集团)，每种菌株处理重复3次。4种菌株于37 ℃，180 r·min-1避光震荡培养，利用紫外-可见分光光度计(UV-1700，Shimadzu，Japan)每2 h测定一次菌悬液在600 nm处的吸光度(OD值)，共计测量7次，将吸光值绘制成细菌生长曲线。

1.6 砷形态分析

将上述4种菌株和只加As(V)的无菌空白对照(Control)共5个处理在LB培养基中培养8 h后，取1 mL菌悬液分别加入到100 mL新鲜的LB培养基中。LB培养基中加入0.3 mmol·L-1IPTG，50 mg·L-1卡那霉素(WC3110和W3110除外)以及20 μmol·L-1Na3AsO4·12H2O，每个处理重复3次。将所有处理于37 ℃、180 r·min-1避光震荡培养12 h后，8 000 r·min-1离心10 min收集菌体和上清液。菌体-50 ℃冷冻干燥后称重，加入5 mL 1% HNO3(优级纯，国药集团)在MARS 5微波消解萃取系统(CEM，USA)中消解。消解程序为：55 ℃维持10 min；75 ℃维持10 min；95 ℃维持30 min。消解液及上清液过0.45 μm滤膜后置于4 ℃保存。采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪联用(HPLC-ICP-MS)(Agilent 7500，Agilent Inc.，U.S.A.)测定滤液中各形态砷的含量。不同砷形态的分离采用PRP-X100阴离子交换柱(Hamilton，U.S.A.；240 mm×4.1 mm)，并配有相同填料的保护柱(11.2 mm，12～20 mm)。流动相含有10 mmol·L-1(NH4)2HPO4和 10 mmol·L-1NH4NO3，pH=6.2。流动相:超纯水体积比=70:30，流动相流速为1 mL·min-1。样品中各砷形态根据标准物质中三价砷As(III)和一甲基砷MMA、二甲基砷DMA、五价砷As(V)的保留时间确定，用winfass积分软件计算峰面积。

1.7 数据统计方法

利用SPSS 20.0软件(SPSS，Inc.，U.S.A.)对细菌的生长曲线数据进行重复测量的单因素方差分析(Repeated measured ANOVA)计算4种菌株生长曲线的差异显著性。

2 结果(Results)

2.1 AMF砷酸盐还原酶基因RiarsC的克隆与序列分析

从异形根孢囊霉R.irregularisDAOM 197198 cDNA中克隆得到了一个砷酸盐还原酶基因RiarsC。测序结果显示完整的开放阅读框(ORF)全长为438 bp，编码145个氨基酸，估测的蛋白质分子量为16.69 kDa，等电点为8.50(Genbank登录号ERZ96229.1)。系统发育树分析显示，在已知的砷酸盐还原酶家族中，RiArsC与谷氧还蛋白-谷胱甘肽依赖的砷酸盐还原酶Grx/GSH家族具有高度的同源性(图1)。

图1 基于邻接法(Neighbor-Joining)构建的RiArsC蛋白与其他细菌、真菌砷酸盐还原酶氨基酸序列系统进化树注：物种名称后显示该蛋白的Genbank登录号，黑色方框所示为RiArsC。Fig. 1 Phylogenetic tree of RiArsC and other arsenate reductases in bacteria and fungi based on the Neighbor-Joining Method using MEGA 7.0.14Note: The accession numbers are shown after the species names. RiArsC is labeled using a black square.

2.2 表达RiarsC基因的E. coli菌株的As(V)抗性分析

砷敏感型E.coli菌株WC3110与野生型菌株W3110相比，敲除了砷酸盐还原酶基因arsC，As(V)还原能力大大降低。重复测量的单因素方差分析结果表明，在较低的As(V)添加水平下(50 μmol·L-1)，WC3110的OD值显著低于W3110，对As(V)的抗性不及野生型菌株W3110(图2a；P<0.05)；在高浓度的As(V)(100 μmol·L-1)处理下，W3110与WC3110相比的生长优势更加明显(图2b；P<0.05)；在As(V)添加浓度为50 μmol·L-1时，表达RiarsC的菌株WC3110+RiarsC与表达空载体的菌株WC3110+pET28a相比对As(V)具有更强的抗性(图2a；P<0.05)；当砷添加浓度升高至100 μmol·L-1时，虽然WC3110+RiarsC与WC3110+pET28a的生长均受到了明显的抑制，但WC3110+RiarsC的生长优势体现得更加明显(图2b；P<0.05)。

2.3 Escherichia coli菌株的砷形态分析

经12 h的培养，野生型E.coli菌株W3110将LB培养基中87.29%的As(V)还原为As(III)，而arsC缺陷型菌株WC3110只将培养基中16.33%的As(V)转化为As(III)(图3a，b)。表达RiarsC的菌株WC3110+RiarsC对培养基中As(V)的还原率为71.04%，比arsC缺陷型菌株WC3110对As(V)的还原能力提高了4.35倍，比表达空载体的菌株WC3110+pET28a还原效率提高了61.98%(图3a，b)。

在E.coli菌体中，WC3110+RiarsC，WC3110+pET28a，WC3110和W3110这4种菌株As(III)占总砷的比例分别为50.24%，17.16%，12.22%和60.69%(图3c，d)。其中，野生型E.coli菌株中As(III)的比例比arsC缺陷型菌株WC3110提高48.47%；表达RiarsC的菌株WC3110+RiarsC与表达空载体的菌株WC3110+pET28a相比，As(III)的比例提高了33.08%。此外，WC3110+RiarsC与W3110菌体中的总砷浓度要明显低于WC3110+pET28a和WC3110(图3c，d)。

3 讨论(Discussion)

砷酸盐还原酶在微生物和植物体的不同砷代谢途径中均发挥着重要的作用。本文从AMF异形根孢囊霉R.irregularis中克隆得到了一个砷酸盐还原酶基因RiarsC。利用异源表达的方法将其导入砷敏感型E.coli菌株WC3110中。结果表明，RiarsC基因的表达提高了E.coli对As(V)的抗性；同时，表达RiarsC的E.coli能够将培养基及体内更多的As(V)还原为As(III)，显著提高了E.coli对As(V)的还原效率。

图2 不同Escherichia coli 菌株的As(V)抗性生长曲线注：图a，b分别表示添加50 μmol·L-1 和100 μmol·L-1 As(V)时，表达RiarsC的E. coli菌株WC3110+RiarsC，表达空载体的E. coli菌株WC3110+pET28a，砷酸盐还原酶基因arsC缺陷型E. coli菌株WC3110(ΔarsC)和 野生型E. coli菌株W3110的As(V)抗性生长曲线；均值±SE，n=3。Fig. 2 The growth curves of Escherichia coli strainsNote: Figure a and b respectively indicate at the As(V) concentrations of 50 μmol·L-1 and 100 μmol·L-1, the growth curves of E. coli bearing RiarsC (WC3110+RiarsC), vector plasmid pET28a (WC3110+pET28a), WC3110 (ΔarsC) and wild type (W3110); means±SE, n=3.

图3 不同Escherichia coli菌株和培养基中的砷形态及浓度注：图a，b分别表示表达RiarsC的E. coli菌株WC3110+RiarsC，表达空载体的E. coli菌株WC3110+pET28a，砷酸盐还原酶基因arsC缺陷型E. coli菌株WC3110(ΔarsC)，野生型E. coli菌株W3110及As(V)无菌空白对照Control处理中液体LB培养基中的砷形态和浓度；图c，d分别表示上述4种E. coli菌体中的砷形态和浓度；均值±SE, n=3。Fig. 3 The As species and concentration in Escherichia coli and LB mediumNote: Figure a and b indicate the As species and concentration in LB medium cultivating WC3110 bearing RiarsC (WC3110+RiarsC), vector plasmid pET28a (WC3110+pET28a), WC3110 (ΔarsC), wild type (W3110) and blank (Control), respectively. Figure c and d respectively indicate the As species and concentration in four different E. coli strains; means±SE, n=3.

生物的砷酸盐还原酶主要包括3个家族(图1)：最早发现的是Grx/GSH家族，它使用谷氧还蛋白(Grx)或谷胱甘肽(GSH)作为电子供体，由ars操纵子上的arsC基因编码，产物为ArsC，主要存在于原核细胞中；第二家族的蛋白产物也叫ArsC，但使用硫氧化还原蛋白(Trx)作为电子供体，被称为Trx家族，与Grx/GSH家族的基因序列和蛋白结构有所不同；第三家族被称作ACR2家族，该家族也使用Grx/GSH作为电子供体，主要存在于真核生物中，如酵母、藻类和植物等[20]。本文从AMFR.irregularis中克隆获得了一个砷酸盐还原酶基因，命名为RiarsC。序列分析结果显示，该基因编码的蛋白序列与Grx/GSH家族的砷酸盐还原酶具有高度的相似性。与通常的分类不同的是，RiArsC并不属于真核生物的砷酸盐还原酶ACR2家族，而与原核生物的砷酸盐还原酶ArsC具有更近的亲缘关系。目前为止，只有极少数真菌的砷酸盐还原酶属于此类，如假裸囊菌属的P.destructans(GenBank: OAF59943.1)和外瓶霉属的E.oligosperma(GenBank: KIW42989.1)等。AMF在将As(V)还原为As(III)的过程中是否利用Grx/GSH 作为还原剂，以及具体的调控机制还需要深入研究。

砷抗性分析结果表明，与野生型E.coli菌株W3110相比，arsC缺陷型菌株WC3110在含As(V)培养基中的生长受到明显的抑制。而表达RiarsC基因的E.coli菌株在含有As(V)的培养基中的生长状况与表达空载体的菌株相比具有更加明显的优势，甚至当As(V)浓度升高至100 μmol·L-1时仍然对As(V)具有一定的抗性。这说明RiarsC基因在一定程度上弥补了E.coli中arsC的功能缺失，增强了菌株WC3110对As(V)的抗性。

E.coli的砷代谢过程由R773质粒上arsRBC操纵子调控，细胞内的As(V)被ArsC还原后再在ArsR和ArsB的共同作用下排出体外[21]。为进一步探究RiarsC提高E.coli对As(V)的抗性机理，我们对E.coli菌体和培养基中的砷进行了形态分析。我们发现，与野生型菌株W3110相比，arsC缺陷型E.coli菌株WC3110对As(V)的还原能力大大减弱，体内积累了更多的砷无法通过As(III)转运通道排出体外，对As(V)的抗性较弱。因此，LB培养基中以As(V)为主要的砷形态。当WC3110转入RiarsC基因后，菌株体内及培养基中的As(III)浓度显著升高，说明这时E.coli菌株重新获得了将As(V)还原为As(III)的能力，体内积累的砷能够以As(III)的形式排出体外。因此该菌株内的总砷浓度大大降低而培养基中的主要砷形态也由As(V)转为As(III)。以上结果证明了RiarsC基因具备将As(V)转为As(III)的能力。

本研究从AMF中克隆得到了一个砷酸盐还原酶基因RiarsC，并通过异源表达的手段初步探讨了该基因的体外功能。结果发现，RiarsC提高了砷敏感型E.coli的As(V)抗性，并且能够将培养基中的As(V)还原为As(III)后排出体外。微生物的砷外排机制主要包括As(V)的吸收，As(V)的还原以及As(III)的跨膜运输。已经有研究鉴定出了AMF砷外排过程中的As(V)吸收通道蛋白GiPT和As(III)跨膜运输过程中的关键基因GiArsA[15]，为AMF的耐砷机制提供了有力的证据。在此基础上，本研究进一步为AMF的砷代谢机理提供了新的分子证据。后续的研究应该在原位开展AMF的砷形态转化和外排机理，明确这些功能基因在AMF砷代谢过程中的相互联系，为AMF的耐砷机制提供更全面的证据。

致谢：感谢国家自然科学基金面上项目(41471219，21677164)对本研究的支持。感谢中国科学院城市与环境研究所朱永官教授对E.coli菌株W3110和WC3110的惠赠。