吴志贤， 曾达武， 林 苏， 朱月永， 刘豫瑞

DNA结合/分化抑制蛋白-1(inhibitor of differentiation/ DNA binding-1，Id-1)属于Id家族，是参与肿瘤形成的重要基因之一[1]。细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)传导途径中最重要的一条信号通路，是一种与细胞增殖、转化和分化等细胞反应有关的胞内关键酶。在前期的体外实验中，本课题组采用针对Id-1特异的siRNA瞬时转染肝癌HepG2细胞系，随着Id-1的沉默，ERK1/2 mRNA及其蛋白和p-ERK1/2蛋白均被有效抑制，推测Id-1基因可能通过激活ERK1/2信号通路参与肿瘤的发生发展[2-3]。近年来，RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术已成为研究基因功能的重要工具，本研究通过构建Id-1特异siRNA的慢病毒表达载体，稳定沉默Id-1表达，在体内环境进一步观察Id-1对肝癌HepG2细胞系裸鼠皮下移植瘤增殖的影响，分析Id-1与ERK1/2信号通路的关系及ERK1/2信号通路在肝癌发生发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂及仪器 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)细胞株HepG2细胞(上海科学院细胞中心)；Id-1-RNAi-Lentivirus(Biomiga上海技术服务中心)；siRNA-Id-1及Lipofectamine 2000(广州锐博生物公司)；Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)；RT-PCR试剂盒(美国Fermentas公司)；鼠抗人ERK1/2单克隆抗体、兔抗人Id-1多克隆抗体及Western印迹荧光试剂(美国Santa Cruz公司)；兔抗人p-ERK1/2多克隆抗体(美国Bioworld公司)；双目倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；实时荧光定量PCR仪(ABI7700，美国ABI公司)；MTT(厦门泰京生物有限公司)；Id-1，ERK1/2及β-actin的PCR引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.1.2动物 清洁级BALA/c nu/nu裸鼠18只，雄性，4～6周龄，16～18 g，购于上海肿瘤动物研究中心[许可证号SCXK(沪)2007-0001]。

1.2方法

1.2.1慢病毒载体构建与病毒滴度测定 委托Biomiga上海技术服务中心制备，5个Id-1 shRNA Sets(以细菌状态保存)的设计与合成购自美国Thermo Scientific公司，其中sh31系列为CCGGACTCGGAATCCGAAGTTGGAACTCG。使用转染试剂Gene Tran将Id-1 shRNA或绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)慢病毒载体与包装载体共转染到293FT细胞中，培养48 h后，收集上清液，浓缩后得到慢病毒浓缩液。将293FT细胞按照每孔5×104的浓度接种Hela细胞，将所收集的慢病毒浓缩液分别按照对数级稀释，将4 μL稀释后的病毒上清液分别加入相应的孔中，过夜培养后，更换培养液，经过1周的筛选后，于显微镜下计数荧光阳性细胞数，计算病毒浓度，筛选最优靶点后进行病毒大量包装。

病毒滴度(TU/mL)=克隆数×稀释倍数

1.2.2重组慢病毒感染HepG2细胞 使用2倍稀释的慢病毒溶液转导(MOI值约等于1)，慢病毒溶液用DMEM稀释，在含2 mL培养基的6 cm平皿中,使用转染试剂Gene Tran将Id-1 shRNA及GFP慢病毒载体与包装载体共转染到293FT细胞中，静置孵育(体积分数为0.05的CO2、37 ℃)48 h后，用4 d的时间使用1 μg/mL嘌呤霉素筛选已转导的HepG2细胞，得到5个Id-1基因沉默和GFP慢病毒稳定表达的HepG2细胞系，并根据显微镜下存活细胞的数量粗略估计慢病毒的转染效率，荧光镜下观察转染细胞的GFP表达情况。

1.2.3半定量RT-PCR筛选Id-1最佳沉默效果的稳定表达HepG2细胞系 收集上述稳定转染的细胞系和未转导的HepG2细胞并进行总RNA提取。Id-1引物通过Primer Express软件(2.0版)设计，长度80 bp(北京鼎国昌盛生物技术有限公司设计并合成)：

上游：5′-TGCTGCTCTACGACATGAACG-3′

下游：5′-TGCTGGAGAATCTCCACCTTG-3′

反转录使用SuperScript II kit(美国Invitrogen公司)试剂盒，50 μL反应体系中加2 μg总RNA模板。PCR进行40个扩增循环，循环条件为第1轮95 ℃ 10 min，随后40个循环为95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min。使用2-ΔCt法进行基因表达水平的相对定量，以管家基因GAPDH RNA的Ct值为准，校正同一样本的模板起始浓度的差异。

1.2.4体内实验 18只BALA/c裸鼠随机分为3组，每组6只。分别收集转染实验组、阴性对照组和空白对照组细胞，以5×106mL-1的浓度接种于裸鼠皮下，每只0.2 mL。每周用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的最长径及最短径。

制作生长曲线并计算实验组肿瘤抑瘤率(inhibitory rate，IR)。4周后处死裸鼠，取出瘤体组织称质量，多聚甲醛固定后石蜡包埋，切片(2片)，行常规H-E染色后行组织学观察，余组织保存备用。

肿瘤体积(mm3)=1/2×A×B2(A、B分别为肿瘤的最大径和最小径)

1.2.5RT-PCR检测肿瘤组织中Id-1及ERK 1/2 mRNA的表达 每种肿瘤组织取100 g提取总RNA。94 ℃预变性5 min，扩增94 ℃ 30 s→57 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，30个循环，最终延伸72 ℃ 7 min。PCR产物均保存于4 ℃的冰箱中。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，结果以目的条带与内参照β-actin的灰度比值表示(对目的基因的表达进行半定量分析)，记录Id-1，ERK 1/2与β-actin的吸光度值，再分别计算二者比值。

目的基因的表达指数=目的基因条带的积分密度值/相应β-actin条带的积分密度值

1.2.6Western-blot法检测肿瘤组织中Id-1，ERK 1/2及p-ERK 1/2蛋白的表达水平 肿瘤组织提取总蛋白后经SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉的TBST封闭30 min，后用一抗[Id-1抗体(1∶200)，ERK 1/2(1∶200)，p-ERK 1/2(1∶500)]4 ℃孵育过夜，加入第二抗体，室温孵育40 min，加ECL化学发光剂1 mL，以β-actin为内参，凝胶扫描仪采集图像。

2 结 果

2.1慢病毒感染效率及最佳稳定细胞系 采用MOI=1的慢病毒上清液转染4 d后，荧光显微镜下观察慢病毒RNAi上GFP的表达(绿色荧光)，得到约80%稳定转染的阳性细胞(图1)。半定量RT-PCR筛选6个稳定转染的细胞系，sh31稳定细胞系目的基因的表达比未转染的HepG2细胞降低了60%左右，而与GFP稳定表达细胞系相比，降低了80%以上，是干扰效率最佳的稳定细胞系。

2.2Id-1-RNAi-Lentivirus对肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤组织形态学和细胞凋亡的影响 常规H-E染色显示，肿瘤细胞呈大片状坏死，空泡性变，多数细胞核完全溶解，细胞结构消失，呈均质、红染表现，可见多数凋亡细胞，细胞质浓缩，细胞核深染固缩(图2)。

A：转染前HepG2细胞形态；B：转染Id-1-RNAi-Lentivirus后的细胞形态；C：转染GFP-Lentivirus后的细胞形态.图1 转染Id-1-RNAi-Lentivirus及GFP-Lentivirus前后的肝癌HepG2稳定细胞系( ×400)Fig 1 HepG2 cell line before and after transfection of Id-1-RNAi-Lentivirus and GFP-Lentivirus( ×400)

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：转染实验组.图2 各组裸鼠皮下肿瘤组织常规染色检查结果(H-E ×400)Fig 2 The pathological results of tumor in different groups (H-E ×400)

2.3Id-1-RNAi-Lentivirus对肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用 接种人肝癌HepG2细胞系后，成瘤率100%。接种成瘤后，转染实验组肿瘤生长速度明显慢于空白对照组及阴性对照组，空白对照组及阴性对照组的肿瘤体积增长迅速，每周测量均有增大，二者差别无统计学意义(P>0.05)，而转染实验组的肿瘤体积增长较为缓慢，肿瘤增长被有效抑制，与对照组比较差别有统计学意义(P<0.05，表2)。实验结束时，转染实验组与阴性对照组、空白对照组皮下瘤体质量比较，差别有统计学意义(P<0.05，图3)。转染实验组与阴性对照组、空白对照组相比，肿瘤抑制率分别为70.6%及68.4%，而空白对照组与阴性对照组的肿瘤体积增长迅速，差别无统计学意义(表3)。

表2 成瘤后各组裸鼠皮下肿瘤的体积变化

n=6. 与空白对照组比较，☆：P<0.01；与阴性对照组比较，△：P<0.01.

与空白对照组及阴性对照组比较，☆：P<0.001.图3 成瘤4周后各组裸鼠皮下瘤体的质量比较Fig 3 Comparison of tumor weights on 4 weeks after subcutaneous transplantation

表3转染实验组相较于阴性对照组及空白对照组的肿瘤抑制率

Tab3Comparison of tumor inhibition rate between transfected group and control group

分 组V4周后皮下肿瘤/mm3IR/%转染实验组728.8±112.1阴性对照组2 478.5±359.770.60空白对照组2 304.0±253.668.40

n=6.

2.4半定量RT-PCR检测各组肿瘤组织中Id-1及ERK1/2 mRNA的表达 Id-1及ERK1/2 mRNA在空白对照组及阴性对照组的裸鼠皮下肿瘤组织中均存在表达，在转染实验组则受到有效抑制(P<0.05,图4，表4)。

2.5Western-blot检测各组肿瘤组织中Id-1,ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达 Id-1,ERK1/2及p-ERK1/2蛋白在空白对照组及阴性对照组的裸鼠皮下肿瘤组织中均存在表达，且表达相似，差别无统计学意义(P>0.05)；而转染实验组的裸鼠皮下肿瘤中，Id-1及p-ERK1/2蛋白水平均被有效抑制，与空白对照组及阴性对照组比较，差别有统计学意义(P<0.01)，但ERK1/2蛋白的表达变化不明显(图5)。

1：空白对照组； 2：阴性对照组； 3：转染实验组. A：Id-1；B：ERK1/2.图4 RT-PCR法检测siRNA对各组裸鼠皮下肿瘤中Id-1及ERK1/2 mRNA表达的影响Fig 4 The effect of siRNA on the expression of Id-1 and ERK1/2 mRNA in subcutaneous tumors in nude mice

分 组Id-1/actin(ERK1/2)/actin空白对照组0.845±0.1130.977±0.082阴性对照组0.917±0.0830.978±0.056转染实验组0.389±0.058☆△0.475±0.079☆△

与空白对照组比较，☆：P<0.01；与阴性对照组比较，△：P<0.01.

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：转染实验组.图5 Western-blot检测RNA干扰前后各组肿瘤组织中Id-1,ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表达Fig 5 Effect of siRNA on the protein level of Id-1, ERK1/2 and p-ERK1/2 in subcutaneous tumor of nude mice by Western-blot

3 讨 论

RNAi技术是一种在转录后水平沉默基因表达的、研究基因功能的强有力工具，具有高特异性、高效率性、高稳定性等优点；siRNA是RNA干扰中重要的效应分子[4]。应用微量siRNA即可使编码基因产物表达量下降90%以上，甚至达到完全敲除[5]。多种肿瘤细胞系的实验也证实，RNAi现象存在于肿瘤细胞中[6]。基因转移方法可分为非病毒学和病毒学2种，因前者转移效率较低，所以绝大多数人体试验的基因治疗方案采用后者进行。经过改构的慢病毒具有感染分裂期和非分裂细胞的能力，可以有效地转染哺乳动物细胞，并能够整合于宿主细胞的基因组，而实现靶基因的稳定沉默，已成为当前基因治疗中载体研究的热点。基因治疗的关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，并得到稳定、高效表达。目前，在长期维持基因敲减效率的载体中，慢病毒载体系统可能是携带siRNA的理想载体之一。因此，本研究选择了慢病毒表达载体介导siRNA特异地抑制Id-1基因的表达，为深入开展研究Id-1的基因功能奠定基础。本研究成功构建Id-1-RNAi-Lentivirus，可有效感染肝癌HepG2细胞，经半定量RT-PCR筛选出干扰效率最佳的靶序列sh31，表明通过构建携带Id-1基因特异性siRNA的慢病毒表达载体，并转染、筛选稳定沉默Id-1基因表达的肝癌HepG2细胞系的方法是可行和有效的，为深入开展研究Id-1对HCC发生发展的影响及可能的分子作用机制奠定基础。

Id-1可以促进细胞的增殖及细胞周期的进展，进而参与肿瘤的发生发展。研究证实，Id-1与HBV感染相关性HCC密切相关[7]。体内研究的初步结果表明，Id-1-RNAi-Lentivirus组的裸鼠肿瘤生长缓慢，瘤体质量明显低于空白及阴性对照组。常规H-E染色也显示，移植瘤组织坏死增多，细胞凋亡增多，增殖缓慢,提示稳定沉默Id-1表达后，能有效抑制裸鼠皮下移植瘤的增长，证明Id-1在促进肝癌肿瘤细胞的增殖、抑制细胞的凋亡中发挥重要的作用。

既往研究证明，ERK1/2也在肝癌组织中高表达，ERK1/2表达与HCC细胞中细胞增殖抗原标记指数呈现明显的相关性，提示ERK1/2的过表达有助于HCC细胞的生长和增殖[8]。ERK也成为肝癌治疗的重要分子靶点之一。

本实验中，Id-1及ERK1/2 mRNA在肝癌组织中均存在高表达，而通过siRNA稳定沉默Id-1基因表达后，ERK1/2在mRNA水平被有效抑制。进一步行Western-blot检测发现，随着Id-1蛋白表达下调，ERK1/2蛋白的磷酸化活性形式p-ERK1/2蛋白的表达亦降低(P<0.05)，但总的ERK1/2蛋白表达变化不大，结合裸鼠荷瘤大小随着Id-1的沉默而受到明显的抑制，提示Id-1可能是通过激活ERK1/2信号通路促进HepG2细胞的增殖。这一结果与本课题组在前期采用化学合成、针对Id-1特异的siRNA瞬时转染体外培养的肝癌HepG2细胞系及食管鳞癌TE-1细胞系、沉默Id-1的结果相一致[2-3]。由此推测，Id-1和ERK1/2在促进肝癌增殖、抑制凋亡中有着密切的关系，Id-1可能通过激活ERK1/2信号通路参与肿瘤的发生发展。但是Id-1如何直接或间接激活调控ERK1/2的信号转导通路，以及其与ERK1/2上下游信号分子存在什么关系，有待进一步深入研究。