吴志贤， 曾达武， 林 苏， 朱月永， 刘豫瑞

DNA结合/分化抑制蛋白-1(inhibitor of differentiation/ DNA binding-1，Id-1)属于Id家族，是参与肿瘤形成的重要基因之一[1]。细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)传导途径中最重要的一条信号通路，是一种与细胞增殖、转化和分化等细胞反应有关的胞内关键酶。在前期的体外实验中，本课题组采用针对Id-1特异的siRNA瞬时转染肝癌HepG2细胞系，随着Id-1的沉默，ERK1/2 mRNA及其蛋白和p-ERK1/2蛋白均被有效抑制，推测Id-1基因可能通过激活ERK1/2信号通路参与肿瘤的发生发展[2-3]。近年来，RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术已成为研究基因功能的重要工具，本研究通过构建Id-1特异siRNA的慢病毒表达载体，稳定沉默Id-1表达，在体内环境进一步观察Id-1对肝癌HepG2细胞系裸鼠皮下移植瘤增殖的影响，分析Id-1与ERK1/2信号通路的关系及ERK1/2信号通路在肝癌发生发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂及仪器 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)细胞株HepG2细胞(上海科学院细胞中心)；Id-1-RNAi-Lentivirus(Biomiga上海技术服务中心)；siRNA-Id-1及Lipofectamine 2000(广州锐博生物公司)；Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)；RT-PCR试剂盒(美国Fermentas公司)；鼠抗人ERK1/2单克隆抗体、兔抗人Id-1多克隆抗体及Western印迹荧光试剂(美国Santa Cruz公司)；兔抗人p-ERK1/2多克隆抗体(美国Bioworld公司)；双目倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；实时荧光定量PCR仪(ABI7700，美国ABI公司)；MTT(厦门泰京生物有限公司)；Id-1，ERK1/2及β-actin的PCR引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.1.2动物 清洁级BALA/c nu/nu裸鼠18只，雄性，4～6周龄，16～18 g，购于上海肿瘤动物研究中心[许可证号SCXK(沪)2007-0001]。

1.2方法

1.2.1慢病毒载体构建与病毒滴度测定 委托Biomiga上海技术服务中心制备，5个Id-1 shRNA Sets(以细菌状态保存)的设计与合成购自美国Thermo Scientific公司，其中sh31系列为CCGGACTCGGAATCCGAAGTTGGAACTCG。……