□ 胡路平 季 昱 杭州市富阳区食品安全检验检测中心

金黄色葡萄球菌是食品中的重要微生物检测指标，是造成食品污染、细菌性食物中毒等的主要食源性致病菌之一。在冷冻食品、动物性食品和蔬菜制品、粮食制品等食品中常有检出[1]。在我国乃至全球，因金黄色葡萄球菌造成的食物中毒事件屡见不鲜。本研究采用检测试纸法[2]、Baird-Parker平板（以下简称BP平板）国家标准法[3]和常规PCR法三种方法，对10-1CFu/ml至103CFu/ml系列浓度梯度的金黄色葡萄球菌试验菌液分别进行定性和定量的检测和试验，通过对不同检验方法的比较和研究，分析各自的优缺点，具有一定的研究价值和现实意义。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料和设备

金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923，购买自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心。BP平板、冻干兔血浆等其它试剂材料，购买自广东环凯微生物科技有限公司。金黄色葡萄球菌PetrifilmTM检测试纸，由美国3M公司生产。全自动微生物鉴定分析仪VITEK 2 Compact及配套GP检测卡、试剂，由法国生物梅里埃制造和生产。实时荧光定量PCR基因扩增仪7500型及配套试剂盒，由美国ABI制造和生产。

1.2 方法

将购得的金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923复活、传代至2代，转种于营养琼脂小斜面，将纯菌苔接种于试管中，36 ℃培养18 h制得试验菌液，菌液浓度约为2.0×105CFU/mL。用无菌生理盐水进行10倍稀释获得相应稀释度菌液。

1.2.1 检测试纸法

方法详见SN/T 1895-2007《食品中金黄色葡萄球菌的快速计数法PetrifilmTM测试片法》。具体检测步骤和判断依据参照检测试纸说明书。

1.2.2 BP平板国家标准法

根据GB4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》第一法定性检验和第二法平板计数法进行实验操作。其中定性检验的主要步骤有检样处理、增菌、分离、镜检、肠毒素检验等，定量实验主要步骤有：检样处理、接种、培养、计数和确认试验等。

1.2.3 常规PCR法(聚合酶链式反应技术）

常规PCR方法能够对致病菌快速定性，但是如果想要进行金黄色葡萄球菌定量分析，则需要在常规PCR 方法的基础上通过加入荧光染料等手段才能实现[4]。本次研究并未对金黄色葡萄球菌进行PCR定量试验。本次定性试验，主要是将一系列稀释度菌液中的金黄色葡萄球菌DNA提取，经过处理与对照一起加入配套试剂上机扩增，最后得出定性结果。

2 结果与分析

2.1 定性检测结果比较

由实验可知，三种金黄色葡萄球菌定性检测方法在本次研究所选取的103CFu/ml至10-1CFu/ml 5个菌液稀释度中，检测灵敏度随着菌液稀释度降低均呈下降趋势，检测灵敏度排序为：BP平板国标法＜检测试纸法＜常规PCR法。在低浓度情况下，BP平板国家标准法（100CFu/ml及更低稀释度）和检测试纸法（10-1CFu/ml及更低稀释度）基本无检出，PCR法在10-1CFu/ml菌液稀释度下仍具有检出率，具体见表1。

2.2 定量检测结果比较

在定量检测中，菌液浓度越高，BP平板国家标准法和检测试纸法因为菌落蔓延和菌落密布，按照国家标准和试纸操作说明均无法计数（具体见表2），检测不具有意义。102CFU/mL菌液稀释度下，BP平板国标法具有检测意义，而检测试纸法仍然无法计数。在低菌液稀释度（10-1CFU/mL）下，BP平板国家标准法灵敏度低、无检出，而检测试纸法有检出，相比而言具有更高的灵敏度。在101CFU/mL至100CFU/mL菌液稀释度，BP平板国标法和检测试纸法均有检出，且计数结果无显著差异。

2.3 其他方面的比较

BP平板国家标准法检验程序相比较而言检验程序较复杂，耗时最长，一般需要2～4 d，当需要快速检测出结果时就较难满足要求。BP平板国家标准法中对检测结果的干扰因素较多，如实验材料（培养基、肠毒素分型试剂盒等）质量、微生物生长环境（温度、湿度、pH等）、杂菌干扰等。同时，会出现受到过热伤害的目的菌在培养基上未生长从而造成的假阴性的情况。但是，BP平板国标法相较而言具有更低的经济成本优势，在不追求检测速度时被广泛地应用。

表1 金黄色葡萄球菌各检测方法的定性结果

表2 金黄色葡萄球菌各检测方法的定量结果

检测试纸法发展至今技术也已较为成熟，获得了很多权威机构的认证，一般需要1～2 d，具有操作简易、实验时间短，不需要配合其他生化鉴定试验、在较低菌液稀释度仍能检出的高灵敏度的优势。检测试纸法成本较高，容易受杂菌干扰，当菌含量较多时不易计数。检测试纸法也会出现因目的菌受到过热伤害而造成的假阴性现象。

常规PCR法一天之内就可出检验结果，甚至几个小时就可完成，具有最高的检出灵敏度和实际检出率，对实验人员实验素质和实验硬件要求很高，实验成本也较高。它的快捷性、特异性和准确性，使它具有非常好的发展前景和重要的现实意义。它不涉及冗长的实验培养、菌落特征、细胞特征和相应的生化试验，经过改进和设计，也可以进行金黄色葡萄球菌的快速的定量检测（本次研究未涉及）。常规PCR法在实验中也会出现出现假阳性、假阴性的情况。常规PCR法可以避免BP平板国家标准法和检测试纸法由于目的菌受热处理伤害而造成的假阴性现象，更加真实可靠地反映食品受金黄色葡萄球菌污染的程度。

3 结论

本研究通过金黄色葡萄球菌的定性实验和定量实验两个方面，简要对比了检测试纸法、BP平板国家标准法和PCR法三种方法的差异，在实验精度、实验周期、实验成本等方面，三种方法各具优缺点。

随着食品检测技术的朝着高准确性、高精度、高灵敏度的方向日益发展，对微生物检测工作者的要求也越来越高。只有通过研究、摸索和实践，将金黄色葡萄球菌等致病菌的传统培养方法和先进科技结合起来，才能更好地提高检测工作效率。

[1]梁金姬,宋德涵,李韵辞,等.金黄色葡萄球菌检测方法研究进展[J].山东化工,2015(10):41-42.

[2]SN/T 1895-2007 食品中金黄色葡萄球菌的快速计数法PetrifilmTM测试片法

[3]国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验:GB4789.10-2016[S].北京:中国标准出版社,2017.

[4]唐梦君,周倩,张小燕,等.种分子生物学方法检测金黄色葡萄球菌的比较研究[J].食品安全质量检测学报,2016(6):2247-2251.

作者简介：胡路平（1988—），男，浙江富阳人，本科，助理工程师。研究方向：食品质量检测。