张 琪，王静慧，花 锦，王如福，侯红萍，霍乃蕊*

（1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801；2.山西出入境检验检疫局，山西 太原 030000；3.山西农业大学 动物科技学院，山西 晋中 030801）

山西老陈醋位列中国四大名醋之首[1]，其大曲以大麦、豌豆为原料，经粉碎加水搅拌，踩压成曲醅，在特定制曲环境中经自然接种而成，富含多种细菌、霉菌、酵母菌等微生物[2]，是酒精发酵阶段的主要糖化发酵剂[3]。GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》[4]规定大曲用量＞62.5%时，可生产pH 3.6～3.9，总酸度为6度以上，不用添加任何防腐剂，可长时间保存，无保质期的山西老陈醋。然而制曲约需21天，从原料到淋出醋也需要20多天，再经至少1年的陈酿，因此生产周期较长，以曲代粮更加剧了其成本。因此应用现代生物技术发掘、优化、规范山西老陈醋传统工艺已被提到议事日程，相关学者及企业家已在菌种强化[5-7]、利用酶工程技术[8]等方面对老陈醋的传统工艺进行了改良，药五忠[9]在酿醋原料液化阶段添加淀粉酶，糖化阶段添加糖化酶和红曲，酒化阶段仅添加40%～50%的大曲和固定化酵母液，减少大曲用量的同时，提高原料利用率，降低成本，增加效益，但其操作繁琐，限制大量微生物的代谢，影响各种香气成分和功能性成分的释放和积累。

麸曲是以麸皮为主要原料，蒸熟后接入纯种霉菌，在人工控温控湿条件下培养的散曲[10-11]。酿制老陈醋所用的原辅料均含有大量的淀粉和纤维素[12]，因此，采用高产糖化酶和纤维素酶的菌种对提高原料利用率至关重要。

本研究以酒精度为评价指标，无需添加外源催化剂，从微生物学角度对传统酿醋工艺进行改良，将菌株制成麸曲，筛选共发酵菌株，将筛选出的菌株与大曲共发酵，确定最优配比，以期减少大曲用量，提高原料利用率，为实际生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米粉、高粱粉、麸皮、稻壳、酿酒酵母、麸曲培养基：均由山西太谷某醋厂提供。

菌株AS3.4309（M0）：山西太谷某醋厂生产快曲的菌株。课题组先期从发酵24 h的酒醅中分离筛选出高产糖化酶菌株，酶活力大小为菌株M6＞M5＞M8＞M15＞M2＞M0；高产纤维素酶菌株，酶活力大小为菌株M4＞M2＞M8＞M15，而菌株M0不产纤维素酶[13]。经中科院微生物研究所鉴定，菌株M4为产黄青霉（Penicillium chrysogenum），菌株M8为扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera），现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC），菌种保藏编号分别为12375和12408。

1.2 仪器与设备

STARTER3100型pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；HFsafe.1200LC型生物安全柜：上海力申科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 各试验菌株麸曲的制作

麸皮、稻壳、水的质量之比20∶1∶16，拌匀，121 ℃灭菌15 min，取出后趁热打散，冷却至30℃。分别接种3 mL各菌株（M0、M2、M4、M5、M6、M8、M15）孢子悬液或菌悬液（107个/mL）于麸曲培养基上，搅拌均匀，30℃培养12～15 h至长出白色菌丝，再扣瓶培养2～5 h，至表面布满白色菌丝或产生少量孢子时取出，置于4℃冰箱中备用。

1.3.2 最佳料水比的确定

根据某醋厂实际生产工艺，取80 g玉米粉，设定料水比1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL），室温润料12 h，蒸1 h，冷却后加玉米粉40%的大曲与麸曲（2∶1），酵母0.06%，25℃恒温生化培养箱中培养。前3d每天搅拌一次，第3天搅拌完后用双层塑料布封口，25℃继续培养4 d，第8天测定酒精度。

1.3.3 大曲用量的确定

设定玉米粉为80 g，大曲用量为玉米粉的20%、30%、40%、50%，料水比为1∶3（g∶mL），酵母0.06%，不加麸曲，25℃发酵7 d，第8天测定酒精度。

1.3.4 大曲与麸曲添加比例的确定

某醋厂实际生产工艺中，大曲与M0麸曲的添加量比例约为1∶1。为进一步优化工艺，以M0麸曲为代表，设定料水比1∶3（g∶mL），大曲与麸曲的添加总量为玉米粉的40%，添加比例为1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。

1.3.5 共发酵优势菌株的筛选

将各菌株制成麸曲替代部分大曲发酵：玉米粉80 g，料水比1∶3（g∶mL），大曲与麸曲的添加总量为玉米粉的40%，添加比例为2∶1，酵母0.06%，25 ℃发酵7 d，第8天测定酒精度，筛选共发酵的优势菌株。

1.3.6 优势菌株与大曲共发酵

（1）菌株M4、M8麸曲最佳添加比例的确定

将菌株M4和M8制成麸曲，与大曲按一定比例接种于酒精发酵液中，由Minitab16混料回归设计确定三者的添加比例，玉米粉80 g、料水比1∶3（g∶mL），大曲与麸曲的添加总量为玉米粉的40%，添加比例为2∶1，酵母0.06%，25℃发酵7 d，第8天测定酒精度。

（2）M4、M8麸曲最佳添加比例下的发酵试验

以上酒精发酵中原料均为玉米粉，但传统山西老陈醋生产原料多为高粱，故分别以玉米粉、玉米粉和高粱粉（3∶7）、高粱粉为原料做发酵试验。80 g玉米粉，料水比1∶3（g∶mL），大曲25.1%，菌株M4麸曲8.09%，菌株M8麸曲6.81%，25℃发酵7 d，第8天测酒精度。再进行醋酸发酵，主料、稻壳、麸皮按12∶15∶20混匀，接入16.67%发酵24 h的醋醅，25 ℃培养。待温度升到40℃左右时翻醅，每天翻醅1～2次，发酵16 d。加入5%的食盐和2倍醋醅总质量的水，泡24 h，淋醋（分两次进行，第一次加7成水泡12 h，淋出头醋，第二次加3成水泡12 h，再淋出）。将两次淋出的醋进行混合，测定醋的质量指标。因试验条件限制，不进行熏醅。

1.3.7 指标测定

（1）各项质量指标的测定

总酸、不挥发性酸、可溶性无盐固形物、还原糖、总酯、氨基态氮均参照GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》[4]的测定方法测定。酒精度的测定采用酒精计法。

（2）原料利用率的测定

总料按发酵原料、辅料和填充料的比例配制，醋糟在80℃烘干，参照GB 18187—2000《酿造食醋》[6]的方法分别测定总料、醋糟还原糖的含量，原料利用率的计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 料水比对酒精度的影响

为提高原料利用率，须选择合适的料水比，为微生物的生长代谢和产酶提供最有利的环境[13]。试验中不同料水比发酵条件下，各菌株的酒精发酵液酒精度见图1。

由图1可知，料水比为1∶3（g∶mL）时，发酵料液的酒精度最高，且接种菌株M8、M6和M4麸曲的发酵液酒精度显著高于M0麸曲（P＜0.05）。加水量较高时，底物浓度较低，不利于菌株的生长和代谢。根据刘忠义等[14]的研究结果发现，料水比低于1∶3（g∶mL）时，发酵料液太稠，不利于酒精发酵，故选择最佳的料水比为1∶3（g∶mL）。

图1 不同料水比对酒精度的影响Fig.1 Effect of different material to water ratio on alcohol content

2.2 大曲用量对酒精度的影响

大曲中含多种菌类，是酿制老陈醋重要的物质基础，大曲用量的多少至关重要[15]，大曲用量对酒精度的影响见图2。

图2 大曲用量对酒精度的影响Fig.2 Effect of Daqu addition on alcohol content

由图2可知，酒精度随着大曲用量的增加，呈先升高后降低的趋势，大曲用量为40%时显著高于其余各组P＜0.05），为10.1%vol。大曲用量较少时，会使酒精发酵不完全或发酵周期延长；较高时，不利于微生物生长代谢，故选择大曲最佳用量为40%。

2.3 大曲与麸曲添加比例对酒精度的影响

大曲与麸曲添加比例对酒精度的影响见图3。

图3 大曲与麸曲添加比例对酒精度的影响Fig.3 Effect of the proportion of Daqu and Fuqu on alcohol content

由图3可知，大曲和麸曲的添加比例为2∶1时，酒精发酵的酒精度接近于只加40%大曲的酒精度，差异不显著（P＞0.05），其余添加比例与只加40%大曲的酒精度差异显著（P＜0.05）。故设定以下试验中大曲与麸曲添加比例为2∶1。

2.4 共发酵优势菌株的筛选

各菌株与大曲共发酵对酒精度影响的结果见图4。由图4可知，菌株M4、M6和M8麸曲与大曲发酵后的酒精度均显著高于菌株M0麸曲（P＜0.05），菌株M8麸曲酒精度最高，分析原因可能是菌株本身就可利用葡萄糖生成酒精，且其产糖化酶活力较高，使葡萄糖转化率提高。由于菌株M4麸曲产纤维素酶能力最强，而菌株M6麸曲不产纤维素酶，故选取菌株M8和M4麸曲用作混合发酵菌株。

图4 菌株强化麸曲与大曲共发酵对酒精度的影响Fig.4 Effect of co-fermentation with strain fortified Fuqu and Daqu on alcohol content

2.5 优势菌株与大曲共发酵

2.5.1 菌株M4、M8麸曲最佳添加比例的确定

大曲与麸曲最佳添加比例2∶1，故采用极端顶点设计法，设置大曲上限为1（100%），下限为0.5（50%），菌株M8麸曲和菌株M4麸曲的上限为0.4（40%），下限为0.1（10%）。大曲与麸曲的总添加量为原料的40%。利用Minitab 16实现混料回归设计，确定菌株M8麸曲（X1）、菌株M4麸曲（X2）和大曲（X3）添加量，试验结果如表1所示。其添加量交互作用的响应面与等高线见图5，方差分析见表2。

表1 M8麸曲、M4麸曲、大曲比例优化Minitab 16混料回归试验设计与结果Table 1 Design and results of mixed material regression experiments for Fuqu M8,Fuqu M4 and Daqu ratio optimization by Minitab 16

图5 菌株M8麸曲、菌株M4麸曲和大曲添加比例对酒精度的影响的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between Fuqu M8,Fuqu M4 and Daqu ratio on alcohol content

由图5（a）可知，3种添加物按一定比例接种于酒精发酵，酒精度比单独接种菌株M8、M4麸曲和大曲的酒精度高。由图5（b）可知，菌株M8、M4麸曲和大曲之间的交互作用比较明显。菌株M8和M4麸曲在较低添加比例时对酒精发酵的酒精度影响较大。这可能因为大曲中微生物种类较多，添加过量时，由于底物浓度的限制，不利于微生物发酵[16-18]，或大量的外来物种改变了大曲中微生物种群结构，抑制某些微生物的生长繁殖，不利于发酵[19-20]；但加入少量菌株M8麸曲或菌株M4麸曲可对发酵起促进作用。酒精度随着大曲添加量的增加先增大后减小；添加少量的菌株M8麸曲或菌株M4麸曲有利于酒精度的提高。

利用Minitab 16软件对表2试验数据进行回归拟合分析，得一次交互回归方程模型为：酒精度Y=-63.31X1-58.7X2-7.73X3+72.95X1X2+157.19X1X3+153.56X2X3。利用线性规划求解上述方程，约束条件为：X1+X2+X3=1.0；0X1≤0.1；0≤X2≤0.1；0≤X3≤0.5。求解得出X1=0.170249，X2=0.202217，X3=0.627 534，即80 g原料中，按40%的比例添加曲，其中大曲25.1%，菌株M8麸曲6.81%，菌株M4麸曲8.09%，安琪酵母0.06%，料水比1∶3，酒精度达11.2%vol。

表2 回归模型的方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

由表2可知，P＜0.01，表明试验所选用模型有高度的显著性，故可用此模型来确定X1、X2和X3的添加比例。从回归方程模型可得，二次项的系数均为正数，表明M8麸曲和M4麸曲、M8麸曲和大曲、M4麸曲和大曲的交互作用较明显，且二次项回归系数绝对值大小为X1X3＞X2X3＞X1X2。说明在酒精发酵时，M8麸曲和大曲的添加比例对酒精度的影响最大，M4麸曲和大曲的添加比例对酒精度的影响次之，M8麸曲和M4麸曲的添加比例对酒精度影响最小。

2.5.2 强化大曲与大曲发酵醋质量指标比较

大曲单独发酵以及M4、M8和大曲共酵对发酵醋指标的影响见表3。由表3可知，本试验没有添加外源催化剂，从微生物学角度对传统酿醋工艺进行了改良，将M4、M8麸曲与大曲共发酵，使新醋中的总酸、不挥发酸、还原糖、可溶性固形物、氨基酸态氮、总酯的含量提高，且食醋各项质量指标均符合国家标准[4]。

表3 麸曲大曲共酵与大曲发酵醋质量指标比较Table 3 Comparison of quality indexes of vinegar by Fuqu+Daqu co-fermentation and Daqu fermentation

2.5.3 M4、M8麸曲与大曲发酵对大曲用量、酒精度和原料利用率的影响

大曲以及大曲麸曲共酵对发酵液酒精度和原料利用率的影响见表4。由表4可知，与单独大曲发酵相比，原料利用率分别提高了25.28%（M0）、25.70%（M4）、28.83%（M8）、31.81%（M4+M8）。同时，以玉米为原料进行发酵时，大曲+M8麸曲+M4麸曲发酵后的酒精度＞大曲+M8麸曲＞大曲+M4麸曲＞大曲+M0麸曲＞大曲。此外，大曲+M4+M8麸曲按最适比例发酵时，每80g原料，大曲用量仅为20.08g，减少了37.25%的用量。

表4 菌株M4、M8麸曲与大曲发酵对酒精度和原料利用率的影响Table 4 Effect of Fuqu M4,M8 and Daqu fermentation on alcohol content and raw material utilization rate

3 结论

Minitab 16混料回归设计试验结果表明，发酵配料时，大曲与麸曲的总添加量为玉米主料的40%，其中大曲25.1%，M8麸曲6.81%，M4麸曲8.09%，安琪酵母0.06%，料水比1∶3（g∶mL），此时酒精度为11.2%vol，且大曲+M8麸曲+M4麸曲共发酵可减少大曲用量37.25%。总之，用麸曲来代替大曲，提高原料利用率的同时，减少大曲用量，节约成本，为老陈醋的加工提供了新的加工理念。

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