杨 姣，徐双兰，赵方允，张春芳，张钰旋，刘丽琼，邢西迁，吴绪伟

(1. 昆明医科大学第一附属医院呼吸内一科，云南 昆明 650032；2. 昆明医科大学附属延安医院呼吸内一科，云南 昆明 650051；3. 昆明医科大学附属延安医院药学部，云南 昆明 650051)

低氧性肺动脉高压以肺血管阻力及肺动脉压力增高为特征，是多种慢性心、肺疾病的病理生理过程，其中肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)的过度增殖引起肺小动脉管壁增厚、管腔狭窄所致的肺动脉压力增高是重要的病理机制[1]。新近研究发现，鞘氨醇激酶1 (sphingosine kinase 1，SphK1)可调控细胞增殖、凋亡、迁移，其已成为治疗肿瘤的新靶点[2]，但目前尚不清楚SphK1是否调控PASMCs的增殖、凋亡和迁移，从而调控肺动脉高压的发生、发展。因此，我们拟应用SphK1的抑制剂二甲基鞘氨醇(N,N-dimethylsphingosine，DMS)干预低氧诱导的大鼠PASMCs,观察其对PASMCs增殖、凋亡的作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂原代培养大鼠PASMCs，具体步骤参见文献[3]。DMS、抗SphK1多克隆抗体、抗RhoA多克隆抗体、抗Rho激酶抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1MTT实验 将细胞分为常氧组、低氧组、低氧+DMS(10 μmol·L-1)组。常氧组置于37℃、5% CO2、21% O2，低氧组置于37℃、5% CO2、1% O2培养箱恒温培养。培养6、24、48、72 h后，按MTT试剂盒说明书检测各组细胞的增殖情况。

1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡 常氧组、低氧组和低氧+DMS(10 μmol·L-1)组细胞培养24 h后，参照细胞凋亡检测试剂盒的说明书进行操作，以流式细胞仪检测PASMCs的凋亡。

1.2.3划痕法检测细胞迁移 处理各组PASMCs，分别制备成单细胞悬液，以无菌200 μL的移液器吸头划痕，各组PASMCs分别处理24 h后，以倒置相差显微镜观察划痕边缘细胞迁移情况并拍照，以Photoshop软件分析PASMCs迁移程度。……