陈军 吴少泽 周盈盈 张素勤 季亢挺

心肌细胞在长时间的缺血状态可导致不可逆转的心肌坏死[1]，长时间的缺血后发生的再灌注不但对缺血心肌无改善作用，反而可引起心肌超微结构破坏，代谢和电生理的损伤，称之为缺血再灌注损伤[2]。心肌梗死是一种致命性的疾病，目前临床上主要的治疗措施是进行冠状动脉介入治疗，短时间内再次开通堵塞的血管，能够有效地减少梗死心肌的损伤，降低患者的病死率[3]。但是，长时间缺血后的介入治疗，血流再通后缺血部位的心肌必然会遭受缺血再灌注的二次损伤[4]。目前，大量的研究证实，氧化应激在缺血再灌注中具有重要的意义，因此抗氧化应激治疗可以减少心肌缺血再灌注损伤[5]。普鲁士蓝纳米颗粒（Prussian blue nanoparticles，PBNPs）是一种具有抗氧化能力的化学合成产物[6]。有研究表明PBNPs可以保护细胞免受紫外、二烯丙基三硫（diallyltrisulfide，DATS）、脂多糖、佛波酯、高糖等培养环境引起的自由基损伤，并且可以保护神经海马细胞在复氧（指糖分和氧气剥夺的复氧过程）过程中的损伤，提示PBNPs是一种潜在的缺血再灌注损伤保护剂[7]。本研究通过PBNPs预处理，观察其在小鼠心肌缺血再灌注中的作用，并探讨潜在的机制，为缺血再灌注的治疗提供新的思路。

1 对象和方法

1.1 研究对象 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级 C57BL/6 小鼠（雄性，20～25g）24 只，购自上海史莱克实验动物技术有限公司，饲养于温州医科大学附属第一医院科研中心SPF级实验动物房（饮用纯净水，标准饲料喂养，自由饮食。生活节律为昼夜12h，恒温恒湿）。H9c2心肌细胞，购自上海中科院细胞库，培养于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，培养基每2d更新一次。

1.2 药物和试剂 PBNPs（南京东纳生物科技有限公司），Evans Blue染料、TTC染料（美国Sigma公司），高糖DMEM培养基、胎牛血清（美国GBICO公司），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所），叔丁基过氧化氢（TBHP，中国阿拉丁公司），SOD一抗、Bcl-2一抗、Bax一抗、GAPDH（美国Abcam公司）。

1.3 实验动物分组 采用随机数字表法将小鼠随机分成4组，每组6只。假手术组（Sham组）：小鼠尾静脉射0.2ml0.9%氯化钠溶液，30min后异氟醚麻醉小鼠，开胸暴露心脏，用7-0的无菌丝线从左冠状动脉前降支（LAD）下通过，不结扎；模型组（I/R组）：小鼠尾静脉射0.2ml 0.9%氯化钠溶液，30min后异氟醚麻醉小鼠，开胸暴露心脏，用7-0的无菌丝线结扎LAD，30min后松开结扎线，再灌注4h，取血、取心脏；低剂量组（I/R+L组）：用200μg/kgPBNPs小鼠尾静脉注射，预处理30min，异氟醚麻醉小鼠，再用7-0的无菌丝线结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注 4h，取血、取心脏；高剂量组（I/R+H组）：用1000μg/kgPBNPs小鼠尾静脉注射，预处理30min，异氟醚麻醉，再用7-0的无菌丝线结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注4h，取血、取心脏[8]。

1.4 心肌梗死面积测定[9]按照上述分组，小鼠心肌缺血再灌注4h后，重新开胸，用2%Evans blue染液从下腔静脉注射到体内，待心脏及小鼠皮肤完全呈现蓝色后，快速取出心脏，用PPS稍冲洗多余染液，将心脏放入切片模具中，用（OCT）包埋，-20℃冰冻20min。垂直心脏长轴切片，1mm/section，切5片，放入1%TTC染液中，37℃孵育15min。心肌未缺血的区域呈现蓝颜色，缺血但尚具有细胞活性的区域被染成红色，称为危险区（area at risk，AAR），缺血且梗死的区域呈现白色，称为梗死区（infract area，INF）。心肌梗死面积使用Image Pro Plus软件计算，最终结果以INF/AAR表示和进行统计。

1.5 细胞生存率检测 为了研究PBNPs对H9c2细胞的保护作用，我们用叔丁基过氧化氢（TBHP）刺激H9c2细胞来模拟缺血再灌注的氧化应激损伤。H9c2细胞铺于96孔板，每孔8 000个细胞，四周边孔不铺，放恒温培养箱培养12h后进行加样检测。用不同浓度的叔丁基过氧化氢刺激H9c2细胞以及不同浓度的PBNPs预干预细胞，培养12h。每孔加入MTT试剂10μl，恒温培养箱继续培养4h，然后用酶标仪570nm测定吸光度。最终结果以空白对照组（加入等量的培养基）生存率为100%进行统计分析。1.6 生化指标检测 按照上述分组，心肌再灌注4h结束时，取小鼠血清，分别测定血清MDA、SOD等生化指标，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 心肌组织中SOD和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的浓度检测 按照上述分组方法，心肌再灌注4h后，取心肌组织，用免疫印迹法（Western blot）检测各组心肌组织中SOD和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的浓度。

1.8 统计学处理 采用SPSS22.0统计学软件，符合正态分布的计量资料以表示,多组间比较采用单因素方差分析,其中两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 各组心肌梗死面积比较 见图1（封三）。

由图1可见，与I/R组比较，I/R+H组的梗死面积[（20.37±3.77）%vs（48.51±3.56）%]明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组心肌细胞生存率比较 见图2。

由图2可见，与空白对照组相比，用100μM和200μM的TBHP刺激细胞能够使细胞存活率显著降低（均P＜0.05）。在随后的细胞实验中，用不同浓度的PBNPs预处理H9c2细胞，然后再用100μM的TBHP浓度来诱导H9c2细胞损伤，最后用MTT试剂盒来检测细胞的生存率，300μg/mlPBNPs预处理组能够显著增加细胞的生存率，结果差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 各组心肌细胞生存率比较[A：不同浓度的TBHP对H9c2细胞活力的影响：在100μM（0.56±0.04）和200μM（0.49±0.03）TBHP组中细胞生存率被显著抑制（与空白对照组比较，*P＜0.05）；B：PBNPs预处理对TBHP刺激的H9c2细胞生存率的影响：300μg/mlPBNPs预处理组（0.97±0.04）显著增加细胞生存率（与TBHP组比较，#P＜0.05）]

2.3 各组SOD活性和MDA水平比较 见图3。

图3 各组SOD活性和MDA水平比较[A：SOD活性统计图；B：MDA水平统计图。与Sham组比较，*P＜0.05；与I/R组比较，#P＜0.05]

由图3可见，I/R组的SOD浓度[（121.2±10.32）nmol/mg]较Sham组[（201±10.1）nmol/mg]显著降低，而I/R+H组较I/R组能够显著增加SOD[（183±11.37）nmol/mg]活性，结果差异有统计学意义（均P＜0.05）。同时，I/R组的MDA浓度[（4.32±0.35）nmol/mg]较Sham组[（1.5±0.11）nmol/mg]显著升高，而I/R+H组较I/R组能够显著降低MDA[（1.84±0.24）nmol/mg]水平，结果差异有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4 各组抗氧化蛋白及凋亡相关蛋白表达水平比较 见图4。

由图4可见，I/R组与Sham组相比，显著增强了凋亡蛋白 Bax（0.73±0.03VS.0.49±0.01，P＜0.01）的表达，减少了 SOD（0.47±0.02VS.0.69±0.02，P＜0.01）和抗凋亡蛋白 Bcl-2（0.32±0.02VS.0.54±0.04，P＜0.01）的表达，而I/R+H组较I/R组相比，PBNPs预处理显著抑制了凋亡蛋白Bax（0.54±0.01）的表达，且增强了 SOD（0.67±0.03）和 Bcl-2（0.53±0.04）的表达，结果有统计学差异（均P＜0.01）。

3 讨论

在本研究中，我们成功构建了小鼠心肌缺血再灌注损伤模型，且发现PBNPs预处理能够显著减少缺血再灌注后小鼠的心肌梗死面积，增加体外心肌细胞存活率，增加缺血再灌注小鼠血清中SOD活性并降低MDA水平，并可以抑制凋亡相关蛋白表达，综上表明PBNPs可通过减少氧化应激和心肌细胞凋亡对心肌缺血再灌注损伤起保护作用。

图4 各组抗氧化蛋白及凋亡相关蛋白表达水平比较[A：各组心肌组织抗氧化蛋白SOD及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2免疫印迹结果条带图；B-D：各组心肌组织抗氧化蛋白SOD及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2条带灰度值统计图，与Sham组比，**P＜0.01，与I/R组比，##P＜0.01]

心肌缺血再灌注损伤是指心肌局部缺血后恢复血流后所产生的不可避免的损伤[10]。这是一个复杂的过程，包括发生在细胞内和细胞外环境中的许多机制，其中一部分由活性氧（ROS）介导。细胞内的ROS主要来源于线粒体的氧化呼吸链，当ROS的产生和清除之间的平衡受到破坏时，可能发生对细胞的不可逆损伤，最终可导致细胞凋亡和坏死[11]。SOD是一种生物酶，他可以通过岐化方式清除体内的超氧阴离子自由基O2-，保护细胞和基质免受氧自由基的损害。其活力的高低反应体内自由基的变化情况。胞外SOD活性的降低，能显著增加氧化应激[12]。而MDA作为氧自由基,它与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化物的程度，间接反应了细胞受自由基的损伤程度[13]。在本实验中，缺血再灌注损伤组（I/R组）较对照组（Sham组）的小鼠血清中SOD活性明显降低，而MDA释放水平明显升高，进一步提示氧化应激的过度激活与小鼠心肌的缺血再灌注损伤密切相关。因此，使用抗氧化剂来治疗心肌缺血再灌注损伤已经成为了一个新的治疗策略[14]。

此外，研究发现，心肌细胞凋亡可能是心肌缺血再灌注损伤发病机制中的另一重要环节[15]。早在1994年，Gottlieb等首先在兔心脏上发现再灌注损伤促进了细胞凋亡[16]。此后姚震等研究表明，不同时间的心肌缺血再灌注损伤均可导致心肌细胞凋亡，以缺血30～60min后再灌注时明显[17]。Bcl-2和Bax是心肌细胞凋亡的调控蛋白，它们同属于Bcl-2家族，前者主要起抗凋亡作用，后者则起到促凋亡作用[18]。本研究中缺血再灌注损伤组（I/R组）较对照组（Sham组）抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显下调，而促凋亡蛋白Bax的表达明显上调，进一步为缺血再灌注损伤引起心肌细胞凋亡提供了理论依据，而如何减少细胞凋亡对防治缺血再灌注损伤的具有重要意义。

普鲁士蓝最早是1706年在德国合成，当时是一种广泛应用的染料。后来，普鲁士蓝逐渐被应用于磁学、光学、电化学和生物医学等领域[19-21]。直至2003年，美国食品和药物管理局（FDA）批准普鲁士蓝作为铊中毒的解毒剂。近年来，Zhang等[7]发现，PBNPs可以模拟三种抗氧化酶的能力：过氧化物酶（POD），过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD），且对羟基自由基（·OH）有很强的亲和力，而PBNPs的这些能力在许多形式的细胞凋亡和细胞死亡过程中，可以作为强有力的ROS清除剂，从而减轻细胞的氧化应激损伤和凋亡[22]。目前尚无关于PBNPs在心肌缺血再灌注损伤中作用的研究。本实验通过构建体外及在体小鼠心肌缺血再灌注损伤模型，发现PBNPs预处理可以通过提高心肌细胞氧自由基的清除能力，抗脂质过氧化能力以及减少心肌细胞凋亡，从而对心肌缺血再灌注损伤提供保护作用。本研究首次阐明了PBNPs对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨了其机制可能是通过抗氧化应激和抗心肌细胞凋亡，为预防和治疗心肌缺血再灌注损伤提供了重要的理论依据，具有重要的现实意义。

然而在我们的研究中仍存在一些限制。首先，在本实验中我们使用的H9c2细胞是源自胚胎BD1X大鼠的心脏组织的大鼠心肌细胞，其具有更多的骨骼肌细胞的特征，因此，如果用成年鼠原代心肌细胞可能能够更好研究PBNPs的潜在作用。第二，我们使用叔丁基过氧化氢刺激H9c2细胞来模仿细胞缺氧和再氧合损伤时产生的氧化应激状态，这有点不同于实际心肌缺血再灌注。第三，在本实验中，我们使用PBNPs预防性给药来治疗局部缺血，而这种预处理方式在某种程度上不太符合临床，大多数患者到医院已发生心肌梗死，因此后续我们将尝试研究PBNPs在心肌梗死中给药的疗效。

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