张 雯 姚豫桐

(四川省医学科学院 四川省人民医院肝胆胰脾&细胞移植中心，四川 成都 610072)

超过80%的肝癌患者在确诊时已经处于癌症晚期，治疗后5年内生存率低于3%〔1，2〕。肝癌易转移、易复发是肝癌致死的重要原因，探究肝癌的发病机制，寻找有效方法提高肝癌患者的生存期是重中之重〔3〕。叉头框蛋白(FOX)E1属于FOX家族的成员，在胚胎发育、分化等过程中发挥关键作用，研究报道，FOXE1在基底细胞癌、甲状腺癌、皮肤鳞癌等中异常表达，并且在癌细胞的发展和转移中发挥决定性作用〔4～6〕。FOXE1在肝癌中表达异常下调，而对于其在肝癌细胞侵袭和迁移中的作用尚不清楚〔7〕。本实验对FOXE1在体外肝癌细胞侵袭和迁移中的作用进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1材料 肝癌细胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和正常肝细胞HL7702购自中科院细胞库；FOXE1 pcDNA3.1购自美国OriGene；FOXE1、β-actin引物均由上海生工合成；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Pierce；电化学发光(ECL)试剂盒购自美国Amersham Biosceiences；胎牛血清购自美国Biochrom；DMEM购自美国Sigma；FOXE1抗体购自美国Bioworld；反转录试剂盒购自大连TaKaRa；qRT-PCR试剂盒购自南京Vazyme；Lipofectamine2000购自美国 invitrogen；基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体、神经钙黏素(N-cadherin)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体、上皮钙黏附素(E-cadherin)抗体购自美国CTS。

1.2qRT-PCR测定FOXE1在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达 取人肝癌细胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和人正常肝细胞HL7702，提取细胞中的RNA，用核酸蛋白仪分析A260/A280的比值1.8～2.0。逆转录合成cDNA，合成产物保存在-20℃。qRT-PCR测定FOXE1水平。引物：FOXE1-正义链：5′-GACCACGGTGGACTTCTAGCG-3′，FOXE1-反义链：5′-CCCTAC-GCTGGCTCACAT-3′。β-actin-正义链：5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′，β-actin-反义链：5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′。以β-actin为内参，根据PCR反应曲线得出阈值循环数，分析Ct值，用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。

1.3Western印迹测定FOXE1在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达 取人肝癌细胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和人正常肝细胞HL7702，在冰上提取细胞蛋白，步骤参照细胞蛋白提取试剂盒。……