王 刚 杨 涛 彭克楠 郭留雄 孙福振 谷守义 刘俊江

(河北省人民医院泌尿外科，河北 石家庄 050051)

膀胱癌具有发病率高、致死率强等特点，且易转移、易复发〔1，2〕。如何减少肿瘤细胞迁移和侵袭是目前延长肿瘤患者生存期的重要途径〔3〕。Twist是一种高度保守的转录因子，其表达上调是诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)的重要原因，也是肿瘤细胞迁移和侵袭的重要诱导因子〔4〕。Twist在肺癌、口腔癌等肿瘤中高表达，研究显示，Twist表达下调后可以降低胃癌、结肠癌等癌细胞的侵袭能力〔5～8〕。本研究旨在探讨Twist对膀胱癌细胞侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1材料 膀胱癌5637、T24、BIU-87细胞和正常膀胱SVHUC-1细胞购自中科院细胞库，5637、T24、BIU-87细胞培养于10%胎牛血清的RPMI1640中，SVHUC-1细胞培养于含有10%胎牛血清的Ham′F12K中，细胞均放在37℃，5% CO2培养箱培养。Prime Script RT逆转录试剂盒、SYBR Premis Ex Taq PCR试剂盒购自大连Takara；RNA提取试剂盒购自北京BioTeke；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自美国ImmunoReagents Inc；波形蛋白(Vimentin)一抗、基质金属蛋白酶(MMP)-9一抗购自美国santacruze；上皮钙黏附素(E-cadherin)一抗、MMP-2一抗购自美国Abcam；Lipofectamine2000购自美国Thermo。

1.2qRT-PCR测定Twist表达 收集膀胱癌5637、T24、BIU-87细胞和正常膀胱SVHUC-1细胞，用RNA试剂盒提取细胞总RNA，同时检测各细胞RNA样品A260/A280的比值(1.8～2.0)。用Prime Script RT反转录合成cDNA后，用SYBR Premis Ex Taq进行qRT-PCR，GAPDH为内参，分析Twist mRNA表达。引物：GAPDH上游5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，下游5′-TGAAGGGGTCATTGATGGCA-3′。Twist上游5′-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3′，下游5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′。引物均由上海英俊生物公司合成。

1.3Western印迹测定Twist表达 收集膀胱癌5637、T24、BIU-87细胞和正常膀胱SVHUC-1细胞，分别用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，添加裂解液，在冰上孵育20 min，期间震荡3次。将细胞转移到离心管中，4℃离心10 min。吸取上清，保存于-80℃。用二喹啉甲酸(BCA)法测定浓度。取蛋白样品，加入到等体积的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝脉电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液中，在沸水中煮5 min。……