覃国忠 史鹏亮 张 震 霍少川

(广州中医药大学，广东 广州 510000)

相关研究认为，IncRNA与miRNA存在相互调控机制，IncRNA可通过内源性吸附miRNA来调控基因表达〔1〕；同时miRNA能够绑定IncRNA，在多种RNA结合蛋白共同帮助下，诱发miRNA介导的沉默机制，调节IncRNA的稳定性〔2〕。研究已证实，miR-21与GAS5 IncRNA之间的反馈调控机制在乳腺癌、骨性关节炎等多种疾病中均有存在〔1〕。因此，人椎间盘退变中过程中miR-155能否通过IncRNA参与调控网络值得探究。本次实验先通过IncRNA芯片检测，明确miR-155过表达后椎间盘髓核细胞IncRNA表达情况，筛选细胞凋亡相关IncRNA，之后对筛选出的GAS5 IncRNA进行初步作用机制分析。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 原代人椎间盘细胞购于美国典型微生物菌种保藏中心；hsa-miR-155过表达慢病毒载体购于上海吉凯基因化学技术有限公司；Cy3、Cy5荧光染料购于天津百萤生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、RIPA蛋白裂解液均购于上海邦奕生物科技有限公司；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗体、B淋巴细胞瘤/白血病(Bcl)-2抗体及内参β-actin抗体购于北京百奥莱博科技有限公司。

1.2方法

1.2.1髓核细胞培养及转染 将冻存的原代人椎间盘细胞水浴复温，2 000 r/min离心10 min，2 ml髓核细胞专用培养基重悬，37℃ 5%CO2培养箱中复苏，48 h换液一次，显微镜下观察细胞融合度超过80%时用胰酶消化后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中传代培养。实验设研究组和阴性对照组，分别设3个平行组，标记为T1～T3和N1～N3。取对数期髓核细胞，以1×106/L接种到培养皿中，按Moi值70的病毒量转染髓核细胞，混匀后放入培养箱中孵育，6 h换液一次，每24 h在显微镜下观察细胞生长情况和转染率，转染后48 h换液，96 h在荧光显微镜下观察绿色荧光率>95%后，每个样品中滴加1 ml Trizol溶液提取细胞总RNA，低温冻存。