吴胜莲 唐少军 靳磊 邵晨霞 杨祎 贺月林

摘要：【目的】评价不同茯苓菌株质量并鉴定其遗传关系，为茯苓菌株资源合理利用及优良菌株选育提供参考。【方法】以11株不同来源的茯苓菌株为研究对象，分别采用平面培养法测定其菌丝生长速率，松树兜栽培法测定其菌核产量，反复转接法测定其遗传稳定性。提取不同茯苓菌株的总DNA，PCR扩增ITS序列，进行ITS序列分析，并构建系统发育进化树。同时检测菌株间的菌丝拮抗性，结合ITS序列分析结果进一步鉴定茯苓菌株遗传关系。【结果】11个供试菌株中，8、9和12号菌株的菌丝生长速率、菌核产量和遗传稳定性均较高，1、7和13号菌株较低。茯苓ITS序列长度为1600 bp，其序列分析结果显示，1、2、3、4、7和10号菌株与Wolfporia cocos intemal transcribed spacer 1的同源性高达100%，8、9、11、12和13号菌株与W.cocos strain LP-13的同源性达99%，表明供试茯苓菌株属于两个不同的亚种。系统发育进化树分析结果显示，1、2、3、4、7和10号菌株聚为一类，菌株间的遗传关系非常接近，存在同种异名的可能；8、9、11、12和13号菌株聚为另一类，菌株间的遗传距离较大，存在种内差异。【结论】通过测定菌丝生长速度、菌核产量和遗传稳定性评价茯苓菌株质量切实可行，ITS序列分析可有效将茯苓菌株鉴定到种级分类单元，并明确茯苓菌株间的遗传关系。

关键词：茯苓；菌株；质量评价；ITS序列；遗传关系

0引言

【研究意义】茯苓（Poria cocos）隶属于多孔菌科茯苓菌属，寄生于松植物的根茎部位，是最早纳入《中国药典》的药用食用菌之一（李燕等，2010），具有健胃、安神、抗癌、增强免疫力等功效（Lee et a1，2004；Chen et al，2010；Lee et al，2013；Sun，2014）。茯苓作为传统中药材，在中药材中的配伍率达80%（张建逵等，2014）。近年来，茯苓产业化水平日益提升，优良菌种是保障茯苓产量和质量的关键，常通过诱变育种、杂交育种、分子育种等手段进行选育和改良（彭卫红等，2005；Wu et al，2016；Xiang et al，2016），从而使其满足产业化生产的需求。但菌种分离、培育等方法存在一定差异，且国内以相互引种替代新品种，导致菌种质量不一致。因此，建立一套茯苓菌株质量评价体系，鉴别茯苓菌株问的生物遗传学差异，明确其遗传关系，对茯苓优良菌株的选育与改良具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外有关茯苓的研究主要集中在营养成分和药理上，对其种质特性研究较少。熊杰等（2006）对茯苓菌丝体、子实体和担孢子的形态特征及适宜的生长发育条件进行了研究，但未对茯苓菌株的质量作出系统评价。谢贤安等（2008）利用ISSR分子标记对8个不同来源的茯苓菌株进行DNA指纹图谱分析，将所有供试菌株完全区分开来，发现其具有丰富的遗传多样性。蔡丹凤（2013）利用RAPD分子标记对国内14个茯苓当家栽培菌株进行DNA指纹图谱分析，并对亲缘关系较远的8个茯苓菌株进行结苓对比，结果筛选出优良菌株川杰1号-A5，其结苓早，产量高。蔡志欣等（2013）利用SRAP分子标记对福建省农业科学院食用菌研究所保藏的32个茯苓菌株进行DNA指纹图谱分析，结果发现10对引物扩增获得23条特异性条带，其中31个茯苓菌株遗传相似系数较高，表明茯苓菌株遗传背景较窄。徐雷等和陈科力（2014）从我国各地收集12个茯苓菌株并开展栽培试验，筛选出适合湖北产区栽培且具有较高经济效益的优良菌株。【本研究切入点】ITS序列分析以其高效率、高准确率而广泛应用于近缘种的分类与鉴定。黄龙花等（2009）将ITS序列分析与碱基比对相结合对凤尾菇的分类地位及拉丁名进行研究，结果证实ITS序列分析在近缘种的分类鉴定上具有较高应用价值。但至今鲜见通过ITS序列分析系统评价茯苓质量并利用菌株问的遗传关系辨别同种异名的研究报道。【拟解决的关键问题】测定不同来源茯苓菌株的菌丝生长速度、菌核产量和遗传稳定性，对其质量进行评价，并分析菌株问的遗传关系，构建系统发育进化树，为茯苓菌株资源合理利用及优良菌株选育提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

供试茯苓菌株编号及来源见表1。Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体、质粒提取试剂盒和1 kb DNALadder Maker均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2试验方法

1.2.1菌丝生长速率测定采用打菌块法将茯苓菌株接种于含PDA固体培养基的培养皿（直径9cm）中，正置于26℃培养箱中培养1d后，每8h测量菌落直径，直至菌落长满培养皿，并计算菌丝生长速率（菌落直径/培养天数）。

1.2.2菌核产量测定采用松树兜栽培法栽培茯苓（蔡丹凤等，2007），栽培9个月后采收，测定每个菌核的重量，以单株菌核的总重量作为菌核产量。每菌株设3次重复。

1.2.3遗传稳定性测定采用打菌塊法将茯苓菌株接种于含PDA固体培养基的培养皿（直径9cm）中，正置于26℃培养箱中恒温培养，菌丝长满后为第1代种，再用同样方法将菌丝转接至新的PDA固体培养基上，菌丝长满后为第2代种，如此反复转接7代，将第7代菌丝以打孔法接种（7块菌块）至摇瓶液体发酵培养基中，同时以第1代为对照，25℃下150r/min振荡培养7d。离心收集菌丝球，60℃烘干至恒重，用电子天平精确称重，测定其生物量大小。3次重复，取平均值。

1.2.4总DNA提取采用改良的氯化苄法（朱衡等，1994）提取茯苓总DNA：用液氮将茯苓菌丝研磨成粉末后，转移至5mL离心管中，加入1mL抽提液（100 mmol/L Tris-HCl，40 mmol/L EDTA，pH 8.0）振荡混匀，加入0.2μL10%SDS、800.0μL氯化苄和1.0μL RNA酶（2.5 U/L）后剧烈振荡，50℃保温1 h（每隔10 min剧烈振荡一次），加入200μL 3 mol/LNaAC（pH 5.2）混匀，冰浴10 min，室温下8000 r/min离心5 min，取上清液，加入等体积异丙醇，室温放置5 min，1000 r/min离心3 min，弃上清液，沉淀用2 mL 70%乙醇洗涤（确保沉淀悬浮起来），自然风干，溶于30μL无菌水中，-20℃保存备用。

1.2.5ITS序列扩增以提取的总DNA为模板，采用通用引物ITS 1（5'-TCCGTAGGTGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）PCR扩增ITS序列。反应体系30.0μL：10xPCR Bu-ffer 5.μL，DNA模板2.0μL，Taq DNA聚合酶2 U，dNTP 3.0μL，正、反引物各1.0μL，以无菌去离子水补足至30.0μL。扩增程序：94℃预变性3 min，94℃45 s，55℃45 s，72℃90 s，进行32个循环；72℃延伸10 min，4℃终止反应。取2.0μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.6重组质粒构建及转化将PCR扩增获得的ITS序列连接至pMDl8-T载体，转入大肠杆菌top10后，提取阳性质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.7ITS序列分析及系统发育进化树构建将ITS序列测序结果在NCBI数据库上进行BLAST比对，从中获取与供试茯苓菌株亲源关系较近的模式菌株ITS序列。运用MEGA 3.1和ClustalX 1.81，采用邻接法构建系统发育进化树。

1.2.8菌株间的菌丝拮抗性检测将茯苓菌株接种到PDA固体培养基，每个平皿接3种茯苓菌株，28℃培养至菌丝覆盖整个平皿，观察各菌株问的菌丝是否有拮抗线。结合ITS序列分析结果进一步鉴定茯苓菌株，以确认ITS序列分析分类的菌株问是否具有菌丝拮抗性。

1.3统计分析

利用SPSS 19.0对试验数据进行方差分析。

2结果与分析

2.1茯苓菌株菌丝生长速率及菌核产量测定结果

由表2可看出，所有茯苓菌株的菌丝生长速度均较快，5 d即可长满培养皿，但不同茯苓菌株的菌丝生长速率和菌核产量存在明显差异，其中以8号菌株的菌丝长势最好，菌丝洁白，气生菌丝粗壮浓密，生长速率最高，达1.82 cm/d，其次是12号（1.80 cm/d）和9号菌株（1.78 cm/d），而1号菌株最低，仅1.60 cm/d，且菌丝较稀疏；菌核产量也以8号菌株最高，达6.76 kg，其次为12号（6.04kg）和9号菌株（5.76kg），以1号菌株最低，仅5.08 kg；8、9和12号菌株的菌核形状规则、肉质纯白，无泡苓、砂苓及跑苓现象，结实程度（比重）较好，1、7和13号菌株呈不规则状，有泡苓现象，质量较差。

2.2茯苓菌株遗传稳定性分析结果

将各菌株传代前后的生物量进行比较，结果如表3所示，2、3、4、8、9、10、11和12号菌株的第7代与第1代发酵生物量无显著差异（P>0.05，下同），但1、7和13号菌株的第7代发酵生物量显著降低，表明1、7和13号菌株的遗传稳定性较差，不适合用于发酵生产。

2.3茯苓总DNA的提取结果

利用改良的氯化苄法能有效提取茯苓总DNA，省时省力，且提取的茯苓总DNA条带清晰（图1），性质稳定，无干扰条带，纯度高，可作为PCR扩增ITS序列的DNA模板。

2.4茯苓ITS序列扩增及比对分析结果

茯苓ITS序列PCR扩增结果显示，PCR产物条带单一且清晰，大小约1600 bp，与预期结果相符（图2）。将PCR产物双向测序后进行拼接，发现茯苓ITS序列大小为1600 bp。将其在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，结果发现相似菌株共有4个，其中1、2、3、4、7和10号菌株与W.cocos intemal tran-scribed spacer 1的同源性高达100%，8、9、11、12和13号菌株与W.cocos strain LP-13的同源性达99%。因此，初步鉴定供试茯苓菌株属于两个不同的亚种。

2.5茯苓菌株的系统发育进化树构建结果

从构建的茯苓菌株系统发育进化树（图3）可知，1、2、3、4、7和10号菌株聚为一类（Group 1），且和4个相似菌株在同一个分支上，表明1、2、3、4、7和10号菌株与4个相似菌株的同源性较高，菌株问的遗传距离为0，存在着同种异名的可能；而8、9、11、12和13号菌株聚为另一类（Group 2），与4个相似菌株均不在同一个分支上。Group 1和Group 2遗传差异大，亲缘关系较远，且Group 2菌株问的遗传距离也较大，存在种内差异。可见，基于系统发育进化树可筛选出遗传差异较大的菌株，为茯苓菌种选育提供亲本材料。

2.6茯苓菌株间的菌丝拮抗性检测结果

选取1、2、3、8和12号菌株进行菌丝拮抗性检测，结果表明，茯苓1、2和3号菌株间无菌丝拮抗线，进一步证实茯苓1、2和3号菌株存在同种异名的可能；但1、2、3号菌株与8、12号菌株间有菌丝拮抗线，表明茯苓1、2、3号和8、12号菌株存在种属差异，属于两个不同的亚种，与茯苓ITS序列分析结果一致。说明茯苓菌株问的菌丝拮抗性可用于鉴别菌株间遗传关系。

3讨论

目前，食用菌菌种杂而混乱，菌种制备不规范，菌种退化且同种异名现象普遍存在，严重影响食用菌产业化的发展，因此，加强食用菌菌株质量评价对食用菌的生产和育种具有重要意义。其中，菌丝生长速率、菌核产量、遗传稳定性等生物学特性是评价食用菌菌种质量的重要指标（王振福，1997）。本研究通过对不同来源茯苓菌株的菌丝生长速率、菌核产量和遗传稳定性进行测定，结果发现，8、9和12号菌株较优质，菌丝洁白粗壮、生长速度快、质地致密、菌丝爬壁能力强，具有浓郁、特殊的茯苓芳香味，尤其是8号菌株，其生长速率和菌核产量均高于其他菌株，且遗传稳定性较高，可应用于实际生产；而1、7和13号菌株培养6 d后菌丝褐化，培养基有色素产生，且菌核产量较低，遗传稳定性較低，质量较差，不适用于生产。

菌株生物学特性能反应菌种质量的优劣，但无法鉴定菌株的种属及遗传关系，难以鉴别是否同种异名。由于茯苓无菌丝锁状联合且子实体形成时间长（Lindner and Banik，2008），缺乏可靠的形态学和生化鉴定指标，对茯苓菌株种属鉴定较困难。但通过ITS序列分析和BLAST比对研究茯苓菌株间的基因差异，能简便、快速、客观地揭示其遗传关系（Leeet al，2000；Atsumi et al，2007）。本研究通过ITS序列分析鉴别茯苓菌株问的遗传关系，结果发现11株茯苓菌株可分为两个大类，1、2、3、4、7和10号菌株聚为一类，且遗传距离非常接近，其同源性为100%，推测可能为同一个种，存在同种异名的可能；8、9、11、12和13号菌株聚为另一类，菌株问的遗传距离较大，菌株间存在种内差异。两个大类遗传差异较大，亲缘关系较远。此外，在大多数真菌中存在不亲和性，其是一种识别异己的遗传系统，能引起反应区产生拮抗反应（潘丽晶等，2013）。本研究利用这一原理对不同茯苓菌株进行菌丝拮抗性检测，结果表明，1、2、3号菌株与8、12号菌株存在种属差异，属于两个不同的亚种，与茯苓ITS序列分析结果一致。可见，我国茯苓菌株的遗传差异不明显，需加大茯苓菌种资源的保护及研究力度，促进茯苓产业的可持续发展。

4结论

通过测定菌丝生长速度、菌核产量和遗传稳定性评价茯苓菌株质量切实可行，ITS序列分析可有效将茯苓菌株鉴定到种级分类单元，并明确茯苓菌株问的遗传关系。