蒲相君 王忠文 杨平 张丽丽 张君成

摘要：【目的】分析平板培养基的组分构成对稻曲病菌薄壁分生孢子形成的影响，为薄壁分生孢子的制备培养提供便捷的技术手段。【方法】以4个常规稻曲病菌株Uv-34、Uv-105、Uv-110和Uv-111为试验材料，采取常规的固体培养技术程序，分别测试马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）的马铃薯含量及蔗糖含量对薄壁分生孢子形成的影响、在水（非糖）和4种糖（蔗糖、核糖、木糖和山梨糖）与马铃薯组配形成的固体培养基（PA、PSA、PRA、PXA和PSoA）上的产孢量、在固体培养基上形成孢子数量的时间变化动态及在PA固体培养基上4个菌株的产孢表现。【结果】在PSA培养基中，蔗糖含量为10g/L时产孢量最高（1.69x10⁶个/mL），马铃薯含量以50.0 g/L时的产孢量最高（1.18x10⁶个/mL）。在PA、PSA、PRA、PXA和PSoA等平板培养基上，菌株的产孢量分别为6.98x10⁶、4.63x10⁶、11.92x10⁶、0.84x10⁶和0.01x10⁶个/mL。在15 d的连续培养中，于PSA培养基上培养5d后产孢量开始大幅下降，而在PA和PRA培养基上菌株产孢量基本稳定或保持上升趋势。在PA培养基上，4个供试稻曲病菌株均能正常大量产孢。【结论】稻曲病菌能在含马铃薯的常规固体培养基上产孢；PA是日常制备培养稻曲病菌薄壁分生孢子的简单易用培养基；PRA是制备培养薄壁分生孢子的高产培养基。

关键词：稻曲病菌；薄壁分生孢子；产孢；培养基

0引言

【研究意义】植物病原真菌的繁殖体在病害发生与流行中发挥着重要作用，因而在植物病害研究中经常使用繁殖体材料来研究病菌一寄主的互作关系，以及探索病害的防控途径。稻曲病是国内外水稻生产的重大病害之一，其病原菌稻曲病菌[Usti-laginoidea virens（cooke）Takahashi]可产生子囊孢子、厚壁分生孢子和薄壁分生孢子3种形态的繁殖体（张君成等，2003；张俊喜等，2016），这3种形态孢子均能侵染水稻致病，可用于稻曲病的相关研究。研究工作使用的孢子材料一般需通过试验培养等方法获取，但实验室内培养获取稻曲病菌子囊孢子尚无成功先例，培养获取厚壁分生孢子也存在较大的技术困难，因而当前的相关研究主要使用薄壁分生孢子（俞咪娜等，2013；Zheng et al，2016；Zheng et.al，2017）。培养获取病原菌孢子最关键的技术物质是培养基，适宜的培养基能起到事半功倍的效果。因此，探索稻曲病菌薄壁分生孢子制备的适合培养基，可为薄壁分生孢子的制备培养提供可靠便捷的技术手段，进而保证相关研究工作的顺利开展。【前人研究进展】有关稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养，早期有采用液体培养基振荡培养方法（陆凡等，1996）和静止培养方法（王疏等，1998）的报道，当前多数使用液体培养基振荡培养方法（Han et al，2015；王宇秋等，2016；Yu et al，2016），即使开展产孢基因研究或致病相关基因研究，涉及的孢子培养也是采用液体培养基振荡培养方法（黄磊等，2013；Lu et al，2016）。此外，有研究报道振荡培养的某些操作因素与产孢量有关（时婷婷等，2015）。至今报道振荡培养方法所用的培养基几乎都是PS（马铃薯蔗糖）液体培养基，该培养基中的主要组分为马铃薯。最近有比较各种植物组织组配的培养基对产孢量的影响报道，结果仍是马铃薯组织与蔗糖组配的培养液（PS）更适宜薄壁分生孢子的形成（时婷婷等，2017）。可见，稻曲病菌薄壁分生孢子制备培养技术至今仍是采用PS液体培养基的振荡培养方法，其缺点主要是培养产物含有大量的菌丝体，且培养工作需要配备振荡培养设备。许多植物病原菌孢子的制备培养是采用便捷可靠的固体平板培养方法（Ribas et al，2016；Wiseman et al，2016；高杨杨等，2017；Guiiar-ro et al，2017），然而针对稻曲病菌尚未发现应用固体平板培养方法的报道。【本研究切入点】笔者在日常工作中发现，稻曲病菌也能在固体平板培养基上生长发育形成薄壁分生孢子，且培养基的营养状况对孢子的形成影响较明显，但哪些营养物质有利于孢子形成尚不清楚。【拟解决的关键问题】用常规稻曲病菌菌株材料和常规的平板培养技术程序，通过测定常规PSA培养基各组分的含量与稻曲病菌产孢量的关系、比较蔗糖、核糖、木糖和山梨糖等糖物质对产孢量的影响、观察稻曲病菌在平板培养基上的产孢动态等，寻找能取得较高孢子产量的培养基营养组成，为稻曲病菌薄壁分生孢子的制备培养提供适宜平板培养基。

1材料与方法

1.1试验材料

供试常规稻曲病菌菌株Uv-34、Uv-105、Uv-110和Uv-111，均為广西大学植物病理学实验室保存的菌株。

1.2试验方法

1.2.1移植用孢子液制备取试管斜面培养的供试菌株，移植少量菌丝团人PS液体培养基（马铃薯100g、蔗糖10g和蒸馏水1000mL），置于摇床进行150r/min、28℃培养7 d，然后用1层灭菌纱布过滤培养产物混合液，除去菌丝体，将仅含孢子的液体离心沉淀，用无菌水将沉淀孢子悬浮洗涤1次，重新离心沉淀，再用无菌水将沉淀孢子悬浮和稀释，并用血球计数板进行计数，再用无菌水调配成10⁶个/mL的孢子液，分装于5mL冷冻管保存于25℃恒温箱备用。

1.2.2 PSA培养基蔗糖含量对产孢量的影响用马铃薯煮出液、蔗糖、琼脂和蒸馏水配制成背景基质为马铃薯100.0g、琼脂20g、蒸馏水1000 mL，而蔗糖含量分别为5.0、10.0、20.0和40.0g/L的培养基，常规高温高压灭菌后倒培养平板，植入菌株Uv-111贮备孢子液50μL进行产孢培养。

1.2.3PSA培养基马铃薯含量对产孢量的影响用马铃薯煮出液、蔗糖、琼脂和蒸馏水配制成背景基质为蔗糖10 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL，分别含马铃薯50.0、100.0、200.0和400.0 g/L煮出液的培养基，常规高温高压灭菌后倒培养平板，植入菌株Uv-111贮备孢子液50μL进行产孢培养。

1.2.4不同糖化合物培养基对产孢量的影响先用蒸馏水将糖化合物配成100g/L的糖溶液，用细菌过滤器过滤灭菌，再将灭菌糖溶液分别与经高温高压灭菌的马铃薯琼脂基质混合，形成背景均是马铃薯琼脂但糖化合物不同的培养基，配比为糖化合物10.0g、马铃薯100.0g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，其中糖化合物分别为水（非糖）、蔗糖、核糖、木糖和山梨糖，对应形成的培养基分别为马铃薯琼脂（PA）、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）、马铃薯核糖琼脂（PRA）、马铃薯木糖琼脂（PXA）和马铃薯山梨糖琼脂（PSoA），倒培养平板后植入菌株Uv-111贮备孢子液35μL进行产孢培养。

1.2.5孢子产量与培养时长的关系按1.2.4方法操作配备背景均为马铃薯琼脂，糖化合物分别为水（非糖）、蔗糖和核糖的培养基，倒培养平板后植入菌株Uv-111贮备孢子液35μL进行产孢培养，分别在移植培养5、10和15d后，每种糖培养基处理各取出重复，测定新一代孢子产量。

1.2.6不同菌株在PA培养基上的产孢表现用马铃薯100.0、琼脂20g、蒸馏水1000 mL配备PA培养基，倒培养平板后，分别移植入菌株Uv-34、Uv-105、Uv-110和Uv-111的孢子液50μL进行产孢培养。各菌株移植用的孢子液的贮备时长不等同。

1.2.7产孢培养与后代孢子数量测定所有培养基均用9cm培养皿倒平板，所有测试处理均设3次重复，植入相应的贮备孢子液后，用T形玻棒将孢子液均匀涂抹于平板面上，然后将测试平板转置28℃的恒温培养箱，除测试项有说明外，均为培养5d后取出测定新一代孢子产量。每皿平板加入15mL蒸馏水，用小毛刷刷下平板表面孢子，用血球计数板检测所得孢子液的孢子数量，每重复皿观察80个中方格的孢子数，并换算成每毫升孢子液的孢子数量。

2结果与分析

2.1 PSA培养基蔗糖含量对产孢量的影响

在马铃薯琼脂背景中添加不同含量的蔗糖，形成4个蔗糖含量处理的培养基，移植入菌株Uv-111进行产孢培养，结果（图1）发现蔗糖含量为10.0g/L的培养基产孢量最高，为1.69X10⁶个/mL，显著高于蔗糖含量为5.0和40.0g/L的培养基的产孢量（P<0.05，下同），但与蔗糖含量为20.0g/L的培养基产孢量差异不显著（P>0.05，下同）。表明PSA培养基的蔗糖含量对稻曲病菌薄壁分生孢子产量影响较明显。

2.2PSA培养基马铃薯含量对产孢量的影响

用马铃薯与背景相同的蔗糖琼脂培养基组配，形成不同马铃薯含量的培养基，移植入菌株Uv-111进行产孢培养，结果（图2）发现马铃薯含量为50.0g/L的培养基产孢量最高，为1.18X10⁶个/mL，显著高于马铃薯含量为200.0和400.0g/L培养基的产孢量，但与马铃薯含量为100.0g/L的培养基产孢量差异不显著。表明PSA培养基中马铃薯含量对稻曲病菌薄壁分生孢子产量影响较明显，且在测试范围内马铃薯含量越少越好。

2.3不同糖化合物培养基对产孢量的影响

在马铃薯琼脂背景中添加不同的糖组分，形成5种处理培养基，菌株Uv-111在5种处理培养基中均能生长形成小菌落，但小菌落的产孢量表现差异较明显。由图3可知，添加蔗糖的培养基（PSA）产孢量为4.63x10⁶个/mL，添加核糖的培养基（PRA）产孢量（11.92x10⁶个/mL）远高于添加蔗糖的培养基产孢量，添加山梨糖的培养基（PSoA）产孢量非常少（0.01x10⁶个/mL），而没有添加任何糖的PA培养基产孢量（6.98x10⁶个/mL）显著高于蔗糖处理；以水处理作参照，含核糖的培养基能大幅增加产孢量，而含山梨糖、木糖和蔗糖的培养基不利于孢子形成。表明不同糖化合物对稻曲病菌薄壁分生孢子的形成发育有重大影响。

2.4孢子产量与培养时长的关系

在糖化合物为水（非糖）、蔗糖和核糖的培养基上，随培养时长的增加，菌株Uv-111的产孢量变化存在明显差异。在含蔗糖培养基（PSA）上，培养5 d的产孢量为4.63x10⁶个/mL，随着培养时间的延长，产孢量大幅下降，10d后产孢量只有1.33x10⁶个/mL，显著低于培养5d时的产孢量；而在含核糖（PRA）或水（PA）的培养基上，培养5～15 d的产孢量基本维持不变，或稍有上升的趋势（图4）。观察相应的产孢菌落外观，在含蔗糖培养基上培养10d后可见浓密的非产孢菌丝，而在含核糖或水处理的培养基上培养10～15d后未发现非产孢菌丝，表明在不同的糖营养培养基上稻曲病菌的产孢习性不同。

2.5不同菌株在马铃薯琼脂培养基上的产孢表现

在PA培养基上，4个供试菌株均能形成大量的后代孢子，但菌株问的产孢量存在明显差异，其中以UV-111的产孢量最多，显著高于其他3个菌株的产孢量（图5）。菌株间产孢量存在差异的原因：一是菌株本身的产孢习性存在差异；二是初始移植菌体（活性孢子数量）存在差异。

3讨论

PSA和PS同属植物病理学日常培养的常用培养基，前者为固态，后者为液态，两者主要组分均为马铃薯和蔗糖，其常规用量是马铃薯200 g/L、蔗糖20g/L。当前稻曲病菌薄壁分生孢子制备惯用的液体培养均为常规用量的Ps培养基（俞咪娜等，2013；Han et al，2015；Zheng et al，2017），未见其2个主要组分与产孢数量关系的研究报道。本研究测定PSA组分对稻曲病菌产孢的影响，发现组分马铃薯为50g/L、蔗糖为10g/L的平板培养基稻曲病菌形成的孢子数量最多，说明该培养基的常規用量并不是稻曲病菌产孢的最适用量，至少不是平板培养基的最适用量。

当前稻曲病菌薄壁分生孢子制备多习惯应用蔗糖组配的PS培养基，未见有关研究其他糖物质对产孢数量的影响报道。本研究测试发现，在核糖组配的培养基上，稻曲病菌形成的孢子数量远高于在蔗糖组配的PSA培养基，表明PRA培养基更适合稻曲病菌产孢。试验时发现，没有额外添加糖物质的PA培养基比常规PSA培养基更适合菌株产孢，与当前惯用的液体培养的表现不一致，在液体培养技术中，菌株在PS培养液的产孢量远高于没有添加蔗糖的马铃薯培养液的产孢量（时婷婷等，2017）。

跟踪产孢过程发现，在常规的PSA培养基上培养5d后，稻曲病菌的产孢量呈大幅下降趋势，意味着在实际工作中应考虑培养时间问题，时间过长不利于获得高产的制备效果。而在PA培养基和PRA培养基上，稻曲病菌产孢量在15d内基本保持平稳或增长的趋势，这种表现有利于实际工作应用时不必特别注意培养的时效问题，使得孢子的准备工作与需要使用孢子材料的研究工作环节比较容易衔接。

固体平板培养是普通实验室的常规技术，其操作性和便捷性比液体培养优越，长期以来稻曲病菌一直使用液体培养技术制备培养薄壁分生孢子。本研究结果表明，稻曲病菌在平板培养基上能形成大量孢子，可为稻曲病菌孢子制备培养提供一种更为便捷的技术。特别明显的是PA培养基，该培养基是日常使用的PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）或PSA培养基的基本组分，其容易配制且使用方便；同时，在PA培养基上稻曲病菌的产孢量比PSA培养基上的更高、更稳定，经测试多个菌株均能正常产孢，综合技术操作性及产孢表现，可認为PA是稻曲病菌薄壁分生孢子制备培养简单易用的理想培养基。而PRA培养基是本研究测试产孢量最高的培养基，可作为稻曲病菌产孢培养的高产培养基，有利于产孢量较低的菌株的孢子制备培养。

需要说明的是，核糖、木糖和山梨糖的高温灭菌培养基能强烈抑制稻曲病菌薄壁分生孢子的萌发（张君成等，2009），笔者研究发现这3种糖化合物本身对孢子萌发并无抑制作用，孢子在这3种糖的非高温灭菌培养基上可正常萌发生长并形成小菌落，产生抑制作用是由于高温对糖作用的后果，因此实际使用马铃薯核糖培养基时核糖组分不能采取高温灭菌。

4结论

稻曲病菌在含马铃薯的常规固体平板培养基上能形成大量的薄壁分生孢子；马铃薯琼脂培养基（PA）是日常制备培养稻曲病菌薄壁分生孢子的简单易用培养基；马铃薯核糖琼脂培养基（PRA）是制备培养稻曲病菌薄壁分生孢子的高产培养基。