张庆颜 董小玉 臧乃亮 徐伟文

规律成簇的短回文重复序列（clustered regular⁃ly intespaced short palindromic repeats，CRISPR）/（CRISPR associated 9，Cas9）系统是在原核生物中发现的一种适应性免疫机制，现已广泛应用于分子生物学的相关领域，成为继锌指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）和转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator⁃like effector nucleases，TALEN）技术后的第三代基因编辑工具。该系统靶向精确、价格低廉、构建简单并可同时操作多个基因，自2013年首次应用以来［1］，迅速发展并被广泛应用于微生物研究、植物科学研究、动物科学研究和人类疾病治疗中，一跃成为当今生物科学领域最具影响力的生物技术之一。本文主要介绍了CRISPR/Cas9系统在疾病模型的建立及在遗传疾病治疗、病毒感染性疾病治疗、癌症研究等方面的进展。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理

CRISPR由一段高度保守的正向重复序列和长度相似的间隔序列交替排列组成。Cas基因编码的Cas蛋白能与核酶、核酸酶、聚合酶、解旋酶等结合。CRISPR/Cas9系统根据Cas基因的不同分为Ⅰ～Ⅲ3种类型，其中被广泛应用的是Ⅱ型。Ⅱ型CRISPR/Cas9在gRNA（guide RNA）的引导下实现对DNA的定点切割。其中Cas9功能的实现需要CRISPR转录而来的crRNA与CRISPR重复区互补的tracrRNA（trans⁃activating crRNA，tracrRNA）形成的复合物参与［2］。crRNA和tracrRNA融合进一条单链引导RNA（single guide RNA，sgRNA）的设计发明简化了Cas9蛋白对特定DNA的体外定点切割，并将CRIS⁃PR/Cas9技术应用于编码细胞系和模式生物中。

由CRISPR/Cas9介导的基因编辑中，sgRNA通过互补配对识别基因组中的靶向序列（proto⁃spacer），Cas9酶在剪切基因组时于3′端的PAM（protospacer⁃adjacent motif）序列前产生一个双链的切口（图1）。由于细胞内存在非同源末端连接和同源重组2种修复方式，从而实现目标生物基因组任意位点的序列编辑。……