楚广民 张建波 孙淼淼

肾细胞癌是泌尿系统中仅次于膀胱肿瘤的最常见的恶性肿瘤之一，约占肾脏恶性肿瘤的85%［1］。肾癌对于传统药物和放射治疗不敏感，预后相对较差，所以寻找新的治疗方法显得尤为重要。SOX9（sex determining region Y⁃box 9）属于SRY（sex determination region of Y chromosome）相关基因家族，目前为止共发现20多个SOX基因家族，其共同特点是各个基因都含有一个保守的HMG⁃box DNA 结合域［2］。有研究表明，SOX9基因的表达异常与结直肠癌、肺癌及胰腺癌等多种肿瘤进展相关［3⁃5］。目前干扰SOX9基因表达对肾癌细胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤的影响仍有待进一步研究。本研究采用小干扰RNA（small interfer⁃ing RNA，siRNA）技术沉默下调肾细胞癌786⁃O细胞中SOX9基因的表达，检测其对786⁃O细胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤的影响，为肾细胞癌的临床治疗提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

肾细胞癌786⁃O细胞株购自ATCC（American Type Culture Collection）。细胞培养基为RPIM⁃1640（美国Hyclone公司），其中添加10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL及链霉素100 IU/mL。所用实验动物均为BALB/c雌性裸鼠，4～6周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要仪器和试剂

Multiskan FC酶标仪购自美国Thermo公司，cx41荧光显微镜购自日本Olympus公司。Hoechst 33342细胞凋亡试剂盒购于北京联科生物科技有限公司，CCK⁃8试剂盒购于日本东仁化工公司，免疫组织化学抗体Ki⁃67购自美国Santa cruz公司。

1.3 实验与方法

1.3.1 siRNA细胞转染及qPCR

SOX9siRNA 有效序列为：上游：5′⁃AG⁃CAAGTCCGCGAGCCAGTAC⁃3′，下游：5′⁃GGT⁃GTGCCTTCTGTGCTGCAC⁃3′；对照组序列为：上游：5′⁃UCCACUGTCACUGGUCCGATT⁃3′，下游：5′⁃CGUGACAGUGCCGAGAAT⁃3′。具体转染方法如下：细胞生长融合度为70%～80%时，按操作说明书，分别将INTERFERINGTM转染试剂（Poly⁃plus Transfection公司，法国）和SOX9 siRNA或阴性对照序列（50 nmol/L的终浓度）加入786⁃O细胞培养液中，将细胞继续置于细胞孵化箱中转染。48 h后，收集细胞用于后续功能检测。……