陈传平，吴剑峰，夏和先，陈乃东

(1.皖西卫生职业学院，安徽 六安 237005；2.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012)

黄酮类化合物作为一类重要的天然产物，具有多种药理活性，如抗肿瘤、抑菌、抑制自由基的生成以及降低脂质过氧化等[1-2]。金樱子(RosalaevigataMichx)，系蔷薇科蔷薇属常绿灌木的果实，其中所含的黄酮类化合物，也具有抗氧化[3]、降低大鼠全血黏度及抑制血小板聚集等作用[4]。

氧化应激是由于体内氧化性物质与抗氧化性物质之间的失平衡，引起体内氧化性物质浓度过大而导致的损害[5],而与氧化应激密切相关的活性氧(ROS)作为调节血管功能的重要信号分子，一直是近年来高血压研究的热点[6]。现代医学认为，过量的ROS是机体氧化损伤重要因素之一，正常生理状态下，机体代谢过程中产生的ROS与其清除抑制剂处于动态平衡。当体内产生过量的ROS时，会使多不饱和脂肪酸过氧化而生成脂质过氧化物，MDA是脂质过氧化物的最终产物，它能使蛋白质、核酸、脂类发生交联，生物膜变性、衰老或死亡等[7]。因此，测定MDA能反映机体脂质过氧化的程度，间接地反映细胞损伤的程度。细胞内存在清除ROS的体系如SOD，能促使超氧化物阴离子变为H2O2和O2，使细胞免受损伤。因此SOD活性降低能够反映体内组织细胞ROS清除能力下降、抗氧化反应降低、损伤加重[8]。CAT是过氧化物酶体的标志酶，其主要作用是催化H2O2，清除体内的过氧化氢，减轻和阻断脂质过氧化作用，预防ROS导致疾病的发生[9]。GSH-px在体内能使形成的ROS进行原位解毒，过氧化氢分解，减少羟自由基的产生，还可使有害的脂质过氧化物分解成相应的醇类。血管内皮具有维持血管张力、参与管壁炎症修复、调节血管生长等多种重要的生理功能，正常血管里NO由内皮细胞产生，作用在平滑肌细胞上，起到舒张血管的作用[10]，NOS为催化内源性NO生成的关键酶，原发性高血压患者的基础NO释放减少，与内皮功能障碍有关，因此NO-NOS体系对心血管疾病的发生发展及相关机制的影响也逐渐为研究者关注[11]。

氧化应激产生的活性氧参与血管内皮损伤的多个环节，保护血管内皮功能成为防治血管性疾病的关键环节[12]。体外实验表明，金樱子黄酮类化合物，能明显消除超氧阴离子自由基，抑制羟自由基对细胞膜的破坏而引起的溶血和脂质过氧化产物的形成[13]；乙醇提取物(粗黄酮)能显著降低血清病型肾炎模型大鼠尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平，以及升高血清总蛋白含量、抗动脉粥样硬化，减轻肾组织的病理变化[14]。曹运长等报道了金樱子总黄酮对体外培养的过氧化氢诱导的氧化损伤人脐静脉内皮细胞具有一定的保护作用[15]，本实验采用建立大鼠血管百草枯氧化应激损伤模型[16]，进一步考察了金樱子总黄酮在体内对血管氧化损伤的内皮功能影响，为金樱子黄酮的生物活性及药用价值提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料：金樱子，2015年11月采自安徽省金寨县，品种经皖西学院生物与制药工程学院陈乃东博士鉴定为金樱子(RosalaevigataMichx)。粉碎后用60%乙醇作提取剂提取、大孔吸附树脂纯化得精制金樱子总黄酮[17]，纯度 73.56%，冷冻干燥备用。

实验动物：清洁级雄性Wistar大鼠40只，7 w龄，体重250～300 g，由皖南医学院实验动物研究中心提供，动物合格证号SCXK(皖)2016-0022。在23 ℃、相对湿度60%～70%、光照周期12 h:12 h环境中适应饲养1 w后用于实验。

主要仪器：3100型全自动生化分析仪(Hitachi公司)，RM2245型切片机(上海莱卡公司)，K500型数码显微镜(厦门Motic公司)，MadLab-4c生物信号采集处理系统(北京众实迪创公司)、JZ100肌肉张力换能器(上海益联医学仪器公司)，离体血管环装置(上海唐衡电子公司)，TU-1901双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)，TGL-20M台式高速冷冻离心机(长沙平凡仪器仪表公司)，GL-20G-Ⅱ电子分析天平(上海安亭科学仪器厂)，等。

主要试剂：百草枯(Paraquat，批号STBB6713V，上海Sigma公司分装)；测定试剂盒：超氧化物歧化酶(SOD)(批号：20160415147)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(批号：20160312231)、过氧化氢酶(CAT)(批号：20160422125)、丙二醛(MDA)(批号：20160410115)，一氧化氮(NO)(批号：20160319052)及一氧化氮合酶(NOS)(批号：20160321021)，由上海荣盛生物药业公司提供；HE染色试剂盒(上海奥威生物公司)；乙酰胆碱(Ach)(批号：20160415147，杭州圣隆生物科技公司)；Kerb’s 液(pH 7.4)，按如下配制(mmol / L)：NaCl 117、KCl 4.75、KH2PO41.19、NaHCO325、CaCl2·2H2O 2.54、MgSO4·7H2O 1.19及葡萄糖10.0[11]，现配现用；所有试剂均为AR。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组与给药

将40只大鼠按体重随机分为5组(n=8)：正常对照组、百草枯模型组、黄酮干预低、中、高剂量组。分组后各组喂正常饲料，自由饮水，百草枯模型组及黄酮干预组按10 mg/kg·w-1剂量ip百草枯，对照组ip等体积生理盐水，同时黄酮干预组每天下午2点按25 mg/kg、50 mg/kg及100 mg/kg剂量ig不同金樱子黄酮(用60%酒精溶解后，再用生理盐水配制成500 mg/L基础液)，对照组和百草枯模型组ig等体积蒸馏水，连续12 w。

1.2.2 血清相关指标测定

1.2.3 腹主动脉病理学观察

采血后，断头处死大鼠，打开胸腹腔，沿横膈处向下1.5 cm分离腹主动脉，表面粘连的结缔组织去除后，一部分置于10中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，按厚度5 μm水平横切，脱蜡后用HE试剂盒染色，400倍光镜观察拍照。剩余腹主动脉置0 ℃的Kerb’s液中，用于测定血管环张力。

1.2.4 主动脉离体血管环张力测定

将动脉剪切成约5 mm的环形标本，悬挂于含10 mL Kerb’s 液(37℃)的浴槽中，通以含5CO2+95O2的混合气体于饱和处理的4 ℃ Krebs液中，血管环的一端挂在塑料支架下面的铁钩上，另一端连接于张力换能器，连续通混合气体，血管环的一端连接于张力换能器，记录血管环张力的变化。血管环的基础张力为0.5 g，平衡40 min后，用浓度为6×10-4mol/L KCL溶液收缩血管环15 min，收缩稳定后用Kerb’s 液冲洗至基线，稳定1 h后开始实验。分别用浓度为1×10-12mol/L～1×10-6mol/L的乙酰胆碱 (Ach)使收缩的血管舒张，每隔20min换一次浓度梯度，静息负荷0.5 g，平衡40 min。以6×10-4mol/L的KCL诱发的血管收缩幅度为100%，舒张率(%)= Ach引起舒张的张力/KCL引起的收缩张力×100%，以血管张力恢复到KCL前的水平为100%舒张。血管平滑肌的张力变化通过张力换能器将信号传送到Powerlab软件系统，记录血管环张力变化数值来表示[18-19]。

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，组内前后比较用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。检验结果以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 血清相关生化指标测定结果

各组大鼠血清中MDA和NO水平、SOD、GSH-Px、CAT及NOS活性测定结果如表1所示。与正常对照相比，百草枯处理模型组MDA含量明显升高、NO含量明显降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px、CAT及NOS活性明显降低(均P<0.05)，表明模型组大鼠受到百草枯所致氧化应激损伤，造模成功。与百草枯处理模型组相比，金樱子中高剂量组的所有指标及低剂量组的GSH-Px、NO和NOS均有显著性差异(P<0.05)，其中高剂量组的MDA和CAT与正常对照相比已无显著性差异(P>0.05)。

MDA作为膜脂质发生过氧化的主要终产物之一，其含量高低表明细胞受到胁迫严重程度；SOD、GSH-Px和CAT活性的高低反映了机体清除氧自由基、抗氧化的能力，其水平的高低反映了机体受自由基攻击程度；血管里NO由内皮细胞产生，起到舒张血管的作用，而NOS是催化内源性NO生成的关键酶。从表1中可看出，百草枯氧化损伤的大鼠，通过ig金樱子总黄酮，血清中MDA含量降低，NO含量升高，SOD、GSH-Px、CAT、及NOS活性增加，并呈一定的量效关系，表明金樱子总黄酮对氧化应激引起损伤的大鼠有一定的保护作用。

表1 金樱子总黄酮对氧化应激引起的大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px、CAT、NO及NOS水平的影响

注：*与正常对照组比较：P<0.05；**与百草枯模型对比：P<0.05

2.2 大鼠腹主动脉病理学观察结果

血管的病理形态学比较结果见图1。光镜观察血管病理形态学改变：染色后镜下观察可见正常对照组血管平滑肌排列整齐，内膜光滑；百草枯模型对照组动脉内壁有多层大量泡沫细胞形成，脂质浸润，内皮细胞中有气球样变性，部分细胞脱落，平滑肌细胞排列紊乱；金樱子总黄酮干预各组相对模型对照组病理变化有所减轻，其中高剂量组血管平滑肌排列稍有紊乱，但内膜较光滑，组织炎症细胞浸润不明显。由此可见，金樱子总黄酮能降低氧化应激引起的大鼠动脉内皮损伤程度。

(a) 正常对照组；(b) 模型对照组；(c) 黄酮干预低剂量组；(d) 黄酮干预中剂量组；(e) 黄酮干预高剂量组图1 各组大鼠血管的形态学比较(×400)

2.3 各组大鼠主动脉离体血管环张力测定结果

各组动脉对ACh舒张作用的反应如图2所示。当KCL引起大鼠腹主动脉环的收缩达最大幅度后，各组最大舒张率对ACh有一定的浓度依赖性。不同剂量金樱子总黄酮均对干预的氧化应激损伤模型组内皮完整的血管环具有舒张作用，最大舒张率分别为(49.66±0.52)%、(61.29±0.51)%及(74.73±0.81)%(P<0.05)，均高于模型对照组最大舒张率(45.69±0.42)%，舒张程度与黄酮呈一定的量效正相关，其中最大剂量最大舒张效应与正常组(77.63±0.91)%相比已无显著性差异(P>0.01)。此结果提示，金樱子总黄酮对氧化应激引起的大鼠动脉内皮损伤有一定的保护作用，改善血管的舒张功能。

图2 金樱子总黄酮对氧化应激损伤大鼠动脉血管舒张功能的影响

3 结论

本研究选用百草枯氧化应激损伤血管模型，探讨了金樱子总黄酮对氧化应激损伤血管内皮的保护作用。百草枯与氧反应产生的超氧阴离子在SOD的催化下产生H2O2，接着在Fe2+的催化下分解为羟自由基，因此百草枯可通过提高大鼠体内ROS水平引起氧化应激反应[20]，引起血管氧化应激损伤。通过ig大鼠金樱子总黄酮后，与百草枯模型组相比，中高剂量组的大鼠血清中MDA的含量有所降低，而SOD、CAT、GSH-Px和NOS的活性显著升高，NO水平显著升高(P<0.05)。病理切片显示，百草枯提高大鼠体内氧化应激水平后，动脉内皮组织形成泡沫细胞，出现部分脱落等病理变化，而ig黄酮组动脉内皮损伤明显减轻。大鼠主动脉离体血管环张力测定结果也表明，黄酮组血管环对ACh的舒张血管效应较对模型照组明显增加。以上实验结果提示，金樱子总黄酮可能通过降低大鼠体内的氧化应激反应，增加NO的可利用性以保护内皮功能，具有较强的体内抗过氧化能力及氧化损伤的保护功能。

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Abstract: To investigate the effects of tota Michx on vascular oxidative stress injury in experimental rats l flavonoids in Rosa laevigata. The rats were intraperitoneally injected with paraquat to induce oxidative stress injury in experimental form and give low and middle and high (25 mg/kg kg·d-1, 50 mg/kg kg·d-1, 100 mg/kg kg·d-1) doses of total flavonoids of R. laevigata Michx to for up to 12 weeks. Then the effect of total Flavones of R. laevigata Michx on the above biochemical index is observed; at the same time, abdominal aortas of rats in groups are taken to make blood vessel slices compared pathologically and morphologically, and then the isolated aortic rings are measured and analyzed. Results show that medium-and?high-dose of flavonoids could improve the related biochemical indexes of rats (P<0.05), arterial endothelial injury is alleviated significantly, vascular ring relaxation is dramatically enhanced and decrease oxidative stress in rats to protect their endothelium?function.

Keywords: Rosa laevigata Michx； total flavonoids； rats； oxidative stress; vascular endothelial injury