王 荣 覃海媚 杨凤莲 韦叶生 王俊利

(右江民族医学院,1 附属医院,2 检验科,3 生殖遗传实验室,百色 533000)

在2000年,Chen等[1]首次分析从牛的脊髓中获得的NI250同源物,继而克隆出了神经突起生长抑制因子(neurite growth inhibitor,Nogo)基因。Nogo属于网状蛋白(reticulon protein,RTN)家族的第4 成员,即RTN4。Nogo基因受不同的转录方式可翻译成3种蛋白异构体,包括Nogo-A、Nogo-B及Nogo-C。研究显示Nogo基因多态性和多种肿瘤等疾病密切相关。关于Nogo基因rs2968795G/A位点和rs10496040A/C位点遗传多态性的研究,尚未见报道。但是,不同遗传背景的人群对疾病的易感性表现不同。故本研究建立SNaPshot法和DNA测序技术检测这两个位点的基因型,并分析其多态性在不同人群中的差异。这不仅能丰富人类Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C的遗传多态性资料,也可为深入探讨同一疾病在不同人群中的易感性差异提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取本院体检中心323例无血缘关系的体检者,包括181例男性与142例女性,年龄17～76岁。临床检查及实验室指标均在正常范围内。所有的研究对象均来自广西地区。研究方案在本院伦理委员会批准后进行,研究对象均签署知情同意书。

1.2 样本DNA制备

用EDTA-K2抗凝采血管采集上述研究对象的静脉血3ml,在4℃条件保存。采集标本48h内,取200μl标本按照血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物科技公司)进行DNA提取,-20℃保存待用。

1.3 引物合成

参考NCBI数据库中Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C的碱基序列,运用Primer 3.0在线引物设计软件(http：//primer3.ut.ee/)设计所需特异性引物,由上海生工公司合成。rs2968795G/A位点的上游引物：5-CAGTCTGGTGGCAGAGTATGCTAAA GA-3,下游引物：5-GACAGGATTGTGCTCTCTCAC ACAA-3,延伸引物：5-CAGTCTGGTGGCAGAGTA TGCTAAAGA-3;rs10496040A/C位点上游引物：5-TGCATATCAC AGAGCAAATTCATACCA-3,下游引物：5-AGTGAATACAGTGTACCTTTTGAGA GC-3,延伸引物：5-AGTGAATACAGTGTACCTTT TGAGAGC-3。

1.4 基因型检测

PCR反应体系为20μl,包括：1.0μl DNA、1×GC buffer I (Takara Inc.)、2.5mmol/L Mg2+、0.2mmol/L dNTP,0.2μmol/L 上、下游引物、1U HotStarTaq聚合酶 (Qiagen Inc.)。PCR反应程序：95℃ 2min,94℃ 20s,65℃ 30s,72℃ 1min,循环11次。94℃ 20s,59℃ 30s,72℃ 1min,循环24次。PCR产物经SAP酶和EXOI酶纯化后继续延伸反应。SAP酶纯化延伸产物后在ABI3730XL测序仪上样,用Polyphred软件分析结果。采用DNA测序法证明分型结果。

1.5 统计学处理

采用基因直接计数法计数基因型及等位基因频率。哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)定律检验样本人群是否有代表性。用χ2检验或Fisher精确检验比较各组基因多态性分布差异,运用SPSS 17.0统计软件处理数据。

2 结果

2.1 rs2968795G/A和rs10496040A/C基因分型

rs2968795G/A和rs10496040A/C基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P=0.342;P=0.466,P>0.05),表明样本人群有代表性。rs2968795G/A和rs10496040A/C的扩增长度分别为313bp、567bp。分型结果显示,rs2968795G/A位点存在GG、GA、AA3种基因型,频率分别为18.9%,46.1%,35.0%;rs10496040A/C位点存在AA、AC、CC3种基因型,频率分别为1.2%,16.4%,82.4%。DNA测序结果和基因分型相符合(图1)。

图1 Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C测序图Fig 1 Sequencing map of genotype for Nogo gene rs2968795G/A and rs10496040A/C polymorphismA：The inverted triangles of panels ①-③ indicated GG,GA and AA genotypes of Nogo gene rs2968795G/A,respectively；B：The inverted triangles of panels ①-③ indicated AA,AC and CC genotypes of Nogo gene rs10496040A/C,respectively

2.2 广西人群中2位点的基因多态性分布

rs2968795G/A位点GG、GA、AA基因型及G、A等位基因频率分布在男女两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。rs10496040A/C位点AA、AC、CC基因型及A、C等位基因频率分布在男女两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 广西人群Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C基因型及等位基因频率分布(%)Tab 1 Distribution of genotype and allele frequencies of Nogo geners2968795G/A and rs10496040A/C in Guangxi population (%)

2.3 2位点多态性与其他种群的基因多态性比较

广西人群rs2968795G/A位点基因型和等位基因分布频率与欧洲人及非洲人相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。与北京人和日本人相比,差异无统计学意义(P>0.05);广西人群rs10496040A/C位点基因型及等位基因分布频率与欧洲、非洲和日本人之间差异均有统计学意义(P<0.05),与北京人相比差异无统计学意义(P>0.05)(表2、3)。

表2 Nogo基因rs2968795G/A位点基因型及等位基因频率在不同人群间的比较Tab 2 Comparison of the frequency of Nogo gene rs2968795G/A polymorphism in different ethic and regional groups

表3 Nogo基因rs10496040A/C位点基因型及等位基因频率在不同人群间的比较Tab 3 Comparison of the frequency of Nogo gene rs10496040A/C polymorphism in different ethic and regional groups

3 讨论

Nogo基因定位于人类第2号染色体上(2p13-14),长度约75kb,含有14个外显子(长度为47～2400bp)和8个内含子(长度为19bp～37kb)[2]。Nogo基因的转录受2种启动子调控,其中启动子1负责启动Nogo-A/B的转录,启动子2负责Nogo-C的转录。其中Nogo-A在抑制中枢神经轴突再生和参与肿瘤细胞凋亡中发挥重要的作用。Nogo-B在中枢神经系统及外周组织均有表达,涉及肿瘤细胞凋亡、组织损伤修复和血管内皮再生等病理生理过程。而Nogo-C主要在骨骼肌中表达,在脑、心、肝和脂肪组织也有部分表达,但具体功能尚不十分明确[3-4]。Teng等[5]在神经母细胞瘤细胞的凋亡实验中研究表明,Nogo-A蛋白可抑制神经母细胞瘤细胞的凋亡,在神经母细胞瘤细胞生长过程中起促进作用。Zhang等[6]研究显示rs34917480CAA插入/缺失多态性和子宫肌瘤有相关性,其纯合子增加子宫肌瘤的患病风险。Shi等[7]报道rs71682890缺失型纯合子降低了宫颈鳞状细胞癌的患病风险。袁微等[8]研究显示,rs1012603C/T位点的多态性和缺血性脑卒中相关,T等位基因可能是缺血性脑卒中的易感基因。因此,分析和阐明Nogo基因多态性在不同人群中的分布特征,可为深入研究不同人群中Nogo基因多态性与疾病的发生发展间的关系提供分子遗传学理论基础。

单核苷酸多态性是指在基因组DNA序列中由单个核苷酸改变而引起的多态性,是可遗传变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。不同遗传背景的人群的基因多态性呈现不同的差异,这使得许多学者热衷于探索群体遗传的多态性分布[9-10]。本研究结果表明,广西人群Nogo基因rs2968795G/A位点和rs10496040A/C位点的基因型和等位基因频率在不同性别间比较差异均无统计学意义,表明广西人群中的这两个位点的多态性可能和性别无相关性。进一步将两位点的多态性结果与HapMap公布的不同人群比较,显示广西人群rs2968795G/A的基因型及等位基因频率与欧洲人和非洲人间差异均有统计学意义,而与北京人和日本人比较差异无统计学意义。广西人群rs7575107G/T位点基因型及等位基因分布频率与欧洲、非洲和日本人之间差异均有统计学意义(P<0.05),与北京人相比差异无统计学意义(P>0.05)。引起这种差异可能原因是广西地处我国南方边界,环境相对外界封闭,有独特的地貌和生活习惯[11]。总之,rs2968795G/A位点和rs10496040A/C位点多态性在不同人群中分布呈不同程度的差异。rs2919126C/T和rs7575107G/T位于Nogo基因的内含子区,内含子的基因突变可以影响基因的转录效率,进一步影响蛋白的表达,从而参与疾病的发生发展过程[12]。这种差异可能影响一些相关疾病在不同人群间所反映出不同发病率及临床表现。

近年来,随着分子生物学技术的进步,人们发现不同的遗传背景表现出对疾病的易感性和预后质量呈现出不同差异,这也使得更多学者开始研究基因多态性和疾病间的密切关系。本研究首次开展对广西人群Nogo基因rs2968795G/A位点和rs10496040A/C位点多态性的研究,同时并和不同人群进行比较。为其与相关疾病的研究奠定了基因水平上的基础数据。选取的研究对象来自广西地区,多态性的结果具有一定的区域代表性。此外,由于通婚的普遍性,很难明确到研究对象的具体民族。今后,将深入探讨Nogo基因的单核苷酸多态性和疾病的关系。

参 考 文 献

[1] Chen M S,Huber A B,van der Haar M E,et al.Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1[J].Nature,2000,403(6768)：434-439.

[2] Liu G M,Luo Y G,Li J,et al.Knockdown of Nogo gene by short hairpin RNA interference promotes functional recovery of spinal cord injury in a rat model[J].Mol Med Rep,2016,13(5)：4431-4436.

[3] Schmandke A,Schmandke A,Schwab M E.Nogo-A：multiple roles in CNS development,maintenance,and disease[J].Neuroscientist,2014,20(4)：372-386.

[4] Xu W J,Shen G Q,Li Q.Biological function of Nogo-B[J].Sheng Li Xue Bao,2013,65(4)：445-450.

[5] Teng F Y,Tang B L.Nogo/RTN4 isoforms and RTN3 expression protect SH-SY5Y cells against multiple death insults[J].Mol Cell Biochem,2013,384(1-2)：7-19.

[6] Zhang K,Bai P,Shi S,et al.Association of genetic variations in RTN4 3′-UTR with risk of uterine leiomyomas[J].Pathol Oncol Res,2013,19(3)：475-479.

[7] Shi S,Zhou B,Wang Y,et al.Genetic variation in RTN4 3′-UTR and susceptibility to cervical squamous cell carcinoma[J].DNA Cell Biol,2012,31(6)：1088-1094.

[8] 袁微,王耀辉,蒙兰青,等.神经突起生长抑制因子A基因多态性与缺血性脑卒中患者遗传易感性的研究[J].中华老年心脑血管病杂志,2014,16(7)：682-685.

[9] 李文娜,李克研,宋慧娟,等.西藏藏族人群白细胞介素1β基因-511C/T多态性[J].解剖学杂志,2014,37(1)：92-94.

[10] 盛优静,余冰,耿芝,等.性激素结合球蛋白基因单核苷酸多态性在宁夏回、汉族人群中的分布特征[J].解剖学杂志,2016,39 (1)：86-90.

[11] 梁燕冰,彭丁伟,黄雨晴,等.广西人群EPCR基因3′-非编码区rs9574 C/G位点的多态性[J].临床与实验病理学杂志,2017,33(3)：249-252.

[12] Jo B S,Choi S S.Introns：the functional benefits of introns in genomes[J].Genomics Inform,2015,13(4)：112-118.

(编辑: 刘 芳)