李开言，张飞，田萍，马开，王艳艳，李鸣，王军*

(1.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004；2.河南中医药大学，河南 郑州 450008)

野蔷薇根(Rosa multiflora Thunb)，是蔷薇科Rosaceae蔷薇属Rosa植物多花蔷薇的干燥根皮。其药性苦、涩、寒，无毒；归脾、胃、肾经；是清热、燥湿、活血的收敛药。具有清热解毒、祛风除湿、活血调经、固精缩尿、消骨鲠等功能。研究发现，野蔷薇中总黄酮含量丰富，尤其是根皮中含量最高[1]。研究文献发现，野蔷薇及其变种中含有二氢黄酮(醇)[2]、山柰酚[3]、槲皮素[4]、二氢槲皮素[5]、芦丁[4]、儿茶精[1]、金丝桃苷[6]、查耳酮[7]等丰富的黄酮类成分，这些成分具有抗氧化、降血脂、抑制血栓形成等治疗动脉粥样硬化的功能。在临床上利用其注射液治疗高血脂并伴有高血压症的患者，有明显的降血脂、降血压功能[8]。大量的体内外研究也发现，黄酮类化合物具有良好的改善心脑血管疾病的疗效[9]。本实验主要是探究野蔷薇根总黄酮的提取纯化工艺，为今后的药物开发做准备。

大孔吸附树脂具有大孔网状结构，且孔径与比表面积都比较大，是一种高分子聚合物，不溶于水、酸、碱及乙醇、丙酮、烃类等有机溶剂，具有较高的耐酸、耐碱、耐氧化能力，对热稳定性强[10]。不同极性和含不同官能团的树脂对各类化合物的吸附解吸能力不同，因此需要根据有效成分纯化的要求，选择不同型号的树脂[11]。大孔吸附树脂具有价格低廉、可再生利用、操作简单、对有机成分选择性较高、吸附性能好等优点，适合于中药和天然药物中有效成分的分离、纯化，对促进中药现代化具有重要的作用[12]。

1 仪器与试药

紫外分析仪UV-265FS(SHIMADZU)；超声波清洗器SB-5200DT(宁波新芝生物科技股份有限公司)；旋转蒸发器RE-2000(巩义市英峪高科仪器厂)；循环水真空泵SHB-Ⅲ型(巩义市英欲仪器厂)；低温冷却循环泵DLSB-5/20 ℃(郑州凯鹏实验仪器有限公司)；万分之一天平L-160DTP(LIBROR)。

野蔷薇根购于安徽亳州药材市场，粉碎，过60目筛。

芦丁(HPLC≥98%，上海哈灵生物科技有限公司)；HP-20、HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-500、HPD-600、HPD-722、HPD-826、AB-8、D-101、D-140、D-301、DM-130、NKA-900大孔树脂(勤实科技)；所用试剂均为分析纯。

2 实验内容

试用70%乙醇溶液作为提取剂，对野蔷薇根粉末进行提取，过滤，乙醇溶液回收，浓缩至浸膏状，于冰箱中4 ℃保存备用。

2.1 黄酮的定性鉴别

盐酸-镁粉实验、三氯化铝实验、浓氨水实验均呈现阳性，故可判定野蔷薇根提取物中含有黄酮类化合物。

2.2 标准溶液的制备及标准曲线的绘制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取于180 ℃干燥至恒重的无水芦丁4.43 mg，用70%乙醇溶液溶解并定容于10 mL容量瓶中，超声混合均匀，便制得芦丁对照品溶液，备用。

2.2.2 吸收波长的选择 分别取适量对照品溶液和野蔷薇根醇提液，再依次加入5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，静置6 min；10%硝酸铝溶液0.4 mL，静置6 min；1 mol·L-1氢氧化钠溶液4 mL，静置15 min；70%乙醇溶液定容至10 mL，摇匀。在400～800 nm波长范围扫描，对照品和野蔷薇根醇提物最大吸收波长分别为508.0、498.6 nm，见图1。以对照品最大吸收波长为准，最终选择检测波长为508 nm。

图1 400～800 nm紫外吸收光谱图

2.2.3 标准曲线的绘制 分别精密量取不同体积芦丁对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，按照2.2.2步骤中10 mL反应体系配制溶液，于508 nm处用紫外分光光度法测定各浓度的吸光度。

表1 不同质量浓度芦丁对照品溶液的吸光度测定

以芦丁对照品溶液的质量浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归分析，得到回归方程：Y=7.804X+0.180 4，r=0.999 5。

2.3 野蔷薇根总黄酮的粗提取

2.3.1 提取条件的正交试验设计 在进行野蔷薇根总黄酮回流提取时，保持沸腾温度95 ℃，考察野蔷薇根总黄酮提取时乙醇溶液的浓度、料液比、提取时间3个因素，每个因素选择3个水平进行L9(34)正交设计(见表2)，以野蔷薇根中总黄酮的含量(检测方法如2.2.2)和收膏率(将各组提取液移至已干燥称重的蒸发皿中水浴蒸干，迅速置干燥器中放冷，称重，计算干膏重量)为评价指标，公式(1)计算总黄酮含量，公式(2)计算收膏率，来选择最适提取条件(见表3)。

总黄酮含量(%)=CVn/1000 m

(1)

收膏率(%)=(干膏质量/生药质量)×100%

(2)

式中：C为样品溶液中总黄酮的质量浓度g·L-1；V为提取液稀释定容体积mL；n为稀释倍数；m是野蔷薇根生药粉末的质量g。

表2 野蔷薇根总黄酮提取工艺因素水平

表3 正交试验结果

注：D为空白组； K1、K2、K3为每个因素各个水平下的指标总和；R为极差=平均含量最大值-平均含量最小值。

通过表3直观分析可知，以总黄酮含量和收膏率为指标，各因素影响程度均为A>B>C，A的影响最大。提取条件为组合A1B3C3时，总黄酮含量49.056%，收膏率11.41%；提取条件为组合A1B2C2时，总黄酮含量为47.219%(略低于49.056%)，收膏率12.85%(略高于11.41%)；考虑到组合A1B2C2的成本较低，提取时间较短，乙醇溶剂用量较少，方便后期的浓缩处理，故选择组合A1B2C2为野蔷薇根总黄酮最佳提取条件。在正交试验前已做过乙醇浓度、料液比、提取时间的单因素试验，发现采用溶剂为体积分数30%、40%乙醇提取野蔷薇根得到的总黄酮含量(42.107%、37.804%)均低于50%乙醇提取的总黄酮含量(48.936%)；料液比1∶20(49.036 %)比料液比1∶15(48.936%)得到的总黄酮含量略高，但成本增加较多；提取时间2.5 h(49.107%)与提取时间2 h(48.936%)得到的总黄酮含量基本相同，但提取时间3 h得到的总黄酮含量(44.209%)下降，可能是持续高温提取破坏了部分溶剂中的黄酮。

2.3.2 粗提取 称取1 kg药材粉末，按照2.3.1最佳提取条件提取3次，药液经过滤后，在旋转蒸发仪上进行乙醇回收，浓缩成浸膏，放冰箱中4 ℃封口保存，以备用。

2.4 野蔷薇根总黄酮的纯化

2.4.1 大孔树脂的筛选

2.4.1.1 大孔树脂静态吸附与解吸 将14种大孔树脂分别用95%的乙醇浸泡12 h，充分溶胀后各准确称取1.00 g，加入一定浓度的野蔷薇根总黄酮提取液30 mL，静置吸附24 h，测定未吸附药液中总黄酮浓度。小心倾掉未吸附的药液，用大量去离子水洗至澄清，淋干。加入40 mL 50%乙醇溶液，置于摇床上60 r·min-1解吸4 h，测定解吸液中总黄酮浓度，结果见表4。

吸附量=上样液浓度×上样液体积-流出液浓度×流出液体体积

(3)

(4)

(5)

综合野蔷薇根总黄酮的静态吸附率和解吸率，从中筛选出HPD-400、HPD-600、HPD-826、DM-130型号的大孔树脂来进一步选择。

表4 静态吸附率、解吸率的测定

2.4.1.2 动态解吸能力的考察 采用动态吸附法，通过测定洗脱液中总黄酮的含量来计算解吸率以筛选出最合适的树脂型号。分别准确称取已充分溶胀的HPD-400、HPD-600、HPD-826、DM-130型大孔吸附树脂5.00 g，湿法装柱，用大量去离子水冲洗至无醇味，备用。分别加入50 mL药液上样，当药液没过树脂约一指时，关闭止水夹，静置2 h。用大量去离子水进行水洗除杂，直至流出液澄清透明无颜色。再各加入40 mL 50%乙醇(相当于5倍柱体积)溶液洗脱，流出液定容至40 mL，UV508 nm检测流出液中总黄酮含量，结果如表5。

表5 动态解吸液总黄酮含量的测定

综合静态吸附、解吸和动态解吸能力的考察，选用HPD-400型号的大孔吸附树脂为最佳纯化树脂柱。

2.4.2 野蔷薇根总黄酮纯化因素考察

2.4.2.1 上样浓度的考察 取浸膏37.5 g，去离子水溶至250 mL，过滤配成母液。母液分别稀释为1倍、1.5倍、2倍、2.5倍各原液。湿法装柱，用大量去离子水冲洗至无醇味。准确量取各原液40 mL上样，UV508 nm检测各原液和未吸附液吸光度，见表6。

表6 上样浓度的考察测定

综合对不同浓度药液中总黄酮吸附率的考察，可知稀释1.5倍的浓度是最佳上样浓度。

2.4.2.2 最大上样量的考察 将母液稀释为1.5倍的原液，备用。分别准确量取原液25、30、35、40 mL上样，UV508 nm检测不同体积原液上样后未吸附液吸光度，见表7。

表7 最大上样量的考察测定

注：“—”为原液不经纯化处理。

综合不同上样体积时药液中总黄酮吸附率的考察，可知35 mL是最大上样量。

2.4.2.3 上样流速的考察 准确量取原液35 mL上样，控制上样流速分别为1.5、2、3、6 s/滴，UV508 nm检测不同流速状态下未吸附液吸光度，见表8。

表8 上样流速的考察测定

注：“—”为原液不经纯化处理。

综合不同上样流速时药液中总黄酮吸附率及效率的考察，可知3 s/滴是最佳上样流速。

2.4.2.4 除杂用水量的考察 准确量取原液35 mL上样，控制上样流速为3 s/滴，当药液没过树脂约一指时，关闭止水夹，静置2 h。然后分别用24、32、40、48 mL去离子水按1 s/滴冲洗柱子。UV508 nm检测不同体积去离子水除杂物中总黄酮吸光度，见表9。

表9 除杂用水量的考察测定

注：“—”为原液不经纯化处理。

综合对不同体积去离子水除杂时废液中总黄酮含量的考察，可知使用40 mL去离子水有除杂的最好效果。

2.4.2.5 洗脱液浓度的考察 准确量取原液35 mL上样，控制上样流速为3 s/滴，当药液没过树脂约一指时，关闭止水夹，静置2 h。然后用40 mL去离子水按1 s/滴冲洗柱子，再分别用40%、50%、60%、70%的乙醇溶液洗脱。UV508 nm检测不同浓度洗脱液中总黄酮吸光度，见表10。

表10 洗脱液浓度的考察测定

注：“—”为原液不经纯化处理。

综合对不同浓度乙醇进行洗脱时洗脱液中总黄酮含量的考察，可知50%乙醇溶液为最佳洗脱液浓度。

2.4.2.6 洗脱液用量的考察 准确量取原液35 mL上样，控制上样流速为3 s/滴，当药液没过树脂约一指时，关闭止水夹，静置2 h。然后用40 mL去离子水按1 s/滴冲洗柱子，再用50%的乙醇溶液各24、32、40、48 mL进行洗脱。UV508 nm检测不同浓度洗脱液中总黄酮吸光度，见表11。

表11 洗脱液用量的考察测定

注：“—”为原液不经纯化处理。

综合对不同体积50%乙醇溶液进行洗脱时洗脱液中总黄酮含量的考察，可知32 mL 50%乙醇溶液为最佳洗脱液用量。

2.4.2.7 洗脱速率的考察 准确量取原液35 mL上样，控制上样流速为3 s/滴，当药液没过树脂约一指时，关闭止水夹，静置2 h。然后用40 mL去离子水按1 s/滴冲洗柱子，再分别控制用32 mL 50%的乙醇溶液1.5、2、3、6 s/滴的速度进行洗脱。UV508 nm检测不同流速状态下洗脱液中总黄酮吸光度，见表12。

表12 洗脱液流速的考察测定

综合对32 mL 50%乙醇溶液不同流速进行洗脱时洗脱液中总黄酮含量的考察，可知2 s/滴为最佳洗脱液速率。

2.4.2.8树脂重复使用次数的考察 准确量取原液35 mL上样，控制上样流速为3 s/滴，当药液没过树脂约一指时，关闭止水夹，静置2 h。然后用40 mL去离子水按1 s/滴冲洗柱子，再用50%的乙醇溶液32 mL进行洗脱，流速为2 s/滴。UV508 nm检测未吸附液中总黄酮及洗脱液中总黄酮吸光度，柱子重复4次使用，见表13。

表13 树脂重复使用次数的考察测定

综合对树脂重复使用次数的考察数据，知树脂可以重复使用3次，第4次使用吸附性能下降。

2.4.2.9 纯化工艺的验证 准确量取原液35 mL上样，控制上样流速为3 s/滴，当药液没过树脂约一指时，关闭止水夹，静置2 h。然后用40 mL去离子水按1 s/滴冲洗柱子，再用50%的乙醇溶液32 mL进行洗脱，流速为2 s/滴。UV508 nm检测未吸附液中总黄酮及洗脱液中总黄酮吸光度，做3个平行试验：

表14 纯化工艺的验证

综合3次平行试验结果分析，该提取工艺可进行重复性操作，纯化的总黄酮达到50%以上。

3 讨论

黄酮的定性鉴别实验中，观察到盐酸-镁粉反应空白管和反应管两管均呈红色，可以说野蔷薇根总黄酮中含有花色素成分。正交试验结果分析中，可知乙醇溶液的浓度对野蔷薇总黄酮的提取影响较大。在动态吸附过程中，柱子中装有的棉花对实验的结果存在着一定的影响；不同时间操作对实验的结果也会造成影响。每两项内容实验的结果会有较大些的偏差，但每一项内容的实验结果偏差较小，结果趋势明显。

结合实验的高效性和经济性，该提取工艺和纯化工艺值得推广，可为今后开发利用野蔷薇根提供简便快捷的方法途径。

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