马彦江，于兰兰，刘瑞霞，陈天朝*

(1.河南中医药大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院省级中药炮制技术传承基地，河南 郑州 450000；3.河南省直第三人民医院 药剂科，河南 郑州 450006；4.中牟县中医院 药剂科，河南 中牟 451450)

天麻为兰科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥块茎。味甘，性平，归肝经。具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络之功能[1]。天麻含有天麻素、天麻苷元(对羟基苯甲醇)、天麻多糖、对羟基苯甲醛、柠檬酸、柠檬酸单甲酯、谷甾醇等，天麻多糖能有效调节机体免疫力，具有抗炎、延缓衰老、抗辐射、降低血压的作用[2]。超声提取技术作为一种新型中药提取技术，具有省时、高效、能耗低等优点，已在中药提取中广泛应用[3]。响应面法(Response Surface Methodology，RSM)是集试验设计、数理统计和最优化技术于一体的综合应用方法[4]。与传统的均匀设计与正交设计相比，响应面法具有精度高、次数少、数学模型预测性好等优点，且能反映各因素与响应值之间的关系[5-6]。故本实验以天麻多糖提取率为响应值，运用Design-Expert软件进行Box-Behnken响应面试验设计，对天麻的超声提取工艺进行优化，以期为天麻的深入开发与应用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；SG3300型超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；DZKW-C电子恒温水浴锅(北京科伟永兴有限公司)；Sartorius CP225D电子天平(德国赛多利斯公司)；LXJ-ⅡB离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 材料

天麻药材购自安徽石田中药饮片有限公司，经河南中医学院第一附属医院药检室检验，符合2015版《中华人民共和国药典》规定；D-无水葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-201205)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 蒽酮-硫酸法测定天麻多糖的含量

2.1.1 标准曲线的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品2.77 mg，加无水乙醇定容至25 mL容量瓶中，即得对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至10 mL具塞试管中，加蒸馏水至2.0 mL，精密加入蒽酮-硫酸溶液(精密称取蒽酮0.1 g，加入80%的硫酸100 mL溶解，摇匀)6 mL，摇匀，置100 ℃水浴中，加热15 min，再放入冰水浴中冷却15 min，以相应试剂为空白，在625 nm波长处测定吸光值。得回归方程Y=37.906X-0.029(r=0.999 4，n=7)，结果标准曲线在0.002 8～0.019 4 mg·ml-1线性关系良好。

2.1.2 样品前处理 将天麻块茎在75 ℃时减压干燥后将其粉碎，过80目筛，精密称取药材细粉1 g，加入一定量的水，在一定温度下超声提取一定时间，离心，上清液用三氯甲烷-正丁醇(3∶2)萃取2次，水层加4倍量95%乙醇，放入冰箱静置过夜，滤过，残渣用乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，干燥，即得天麻粗多糖。

2.1.3 多糖含量的测定 采用蒽酮-硫酸法[7-8]，将所得的天麻粗多糖加蒸馏水定容至50 mL，再精密吸取1 mL溶液，加蒸馏水定容至25 mL得样品溶液。精密吸取1 mL置于10 mL试管中。按2.1.1项下操作，测定供试液的吸光度值，用下式计算天麻多糖提取率：

多糖提取率=[样品浓度(mg·mL-1)×样品体积(mL)×定容体积]/[样品质量(g)×103]×100%

(1)

2.2 单因素试验

参考相关文献[9-13]，选定超声提取温度(℃)、提取时间(min)和液固比3个影响因素作为考察对象，每个因素设置5水平，以天麻多糖的超声提取率为指标，初步考察各影响因素。

2.2.1 提取温度对天麻多糖提取率的影响 设置固定液固比为20∶1，超声提取60 min，考察不同的提取温度对天麻多糖提取率的影响，结果见图1。可知，在40～70 ℃，提取率随温度上升显著提高，但当温度大于70 ℃时，提取率增加不明显，考虑到高温对多糖的结构及活性的影响，提取温度选定为70 ℃。

图1 提取温度对多糖提取率的影响

2.2.2 提取时间对天麻多糖提取率的影响 设置固定液固比为20∶1，提取温度为60 ℃，考察不同的提取时间对天麻多糖提取率的影响，结果见图2。可知，在45 min内，提取时间的增加，提取率随之提高，但超过45 min后，提取率呈逐渐下降趋势。这可能是提取时间的增加，部分多糖被破坏降解。故提取时间选定为45 min。

图2 提取时间对天麻多糖提取率的影响

2.2.3 液固比对天麻多糖提取率的影响 设置固定提取时间60 min，提取温度为60 ℃，考察不同料液比对天麻多糖提取率的影响，结果见图3。

可知液固比为15∶1时，天麻多糖提取率明显大于液固比为10∶1与5∶1时；与20∶1和25∶1时相比，差异不大。故液固比选定为15∶1。

图3 液料比对天麻多糖提取率的影响

2.3 运用中心组合试验优化前处理条件

根据Box-Benhnken试验设计原理[3，5-6]，以超声提取温度(X1)、超声提取时间(X2)、液固比(X3)3个因素为自变量，天麻多糖提取率为响应值，设计三因素三水平的响应面分析法对超声提取工艺进行优化，共17个试验点(14个为析因试验，3个为中心试验)。在单因素试验结果的基础上，选定各响应面因素水平，见表1，响应面分析结果见表2。

2.4 模型方程的建立与方差分析

应用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得回归方程：Y=17.17+0.59X1+0.61X2+0.72X3-0.54X1X2-2.14X1X3+

0.37X2X3-1.69X12-4.23X22-3.66X32。对上述回归模型进行方差分析，结果见表3。

表1 响应面因素水平表

表2 响应面分析试验结果

表3 天麻多糖方差分析结果

注：***表示P<0.001，差异极显著；**表示P<0.01，差异高度显著；*表示P<0.05，差异显著。

由表3可知，一次项中提取时间(X2)、液固比(X3)对多糖提取率的线性效应显著，各因素对多糖提取率的影响大小为X3>X2>X1；二次项中提取时间(X2)、液固比(X3)对多糖提取率的线性效应极显著，提取温度(X1)对多糖提取率的线性效应高度显著；交互项中提取温度与液固比(X1X3)对多糖提取率的线性效应极显著。模型的调整确定系数为0.981 2，说明该模型能够98.12%反映相应值随自变量的变化，模型拟合程度较好。在本试验设计范围内，回归方程的失拟项检测P<0.000 1，极显著；回归方程显著性检测P<0.000 1，极显著，证明响应曲面法优化的提取工艺提取天麻多糖是可行的。

2.5 响应曲面分析

响应面曲面可较直观地反映各因素及两两因素的交互作用对响应值的影响。天麻多糖超声提取的二维等高线图与响应曲3D图谱见图4。

注：A.提取温度与提取时间；B.提取温度与液固比；C.提取时间与液固比。图4 各因素对天麻多糖提取率影响的二维等高线和三维响应面曲线图

运用Design-Expert 8.0.6软件优化所得的天麻多糖超声提取最佳工艺：提取温度78.54 ℃、提取时间48.06 min、液固比16.04∶1，在此条件下天麻多糖提取率的预测值为17.25%。

2.6 验证实验

为验证响应面法所得结果的可靠性，对模型优化的工艺条件进行验证。考虑到实验的可行性与便捷性，选择工艺参数：提取温度78 ℃、提取时间48 min、液固比16∶1，重复实验3次，计算天麻多糖提取率，求其平均值为17.22%。与理论预测值基本吻合。

3 讨论

近年来对天麻的提取工艺研究主要有传统水提取法、微波提取法、酶提取法、超声提取法等。超声提取与其他方法相比具有方法简便、提取温度低、时间短、效率高等优点[9，14]，同时避免了高温高热对中药材生物活性的破坏，具有较好的抗氧化作用[15]。

本试验运用三因素三水平的响应面分析法对天麻多糖超声提取工艺的提取温度、提取时间、液固比进行考察，建立了超声工艺的二次多项式数学模型，经过验证实验证明是有效的。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：6.

[2] 陈维红，罗栋.天麻素、天麻多糖药理作用研究进展[J].中国药物评价，2013，30(3)：132-134.

[3] 揭晶，赵越，王皓.Box-Behnken响应面法优化芦笋总皂苷超声提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(8)：8-11.

[4] 张艳，李永哲.响应面法及其在药学领域中的应用[J].吉林化工学院学报，2012，29(7)：20-26.

[5] 彭晓霞，路莎莎.响应面优化法在中药研究中的应用和发展[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(19)：296.

[6] 余小翠，刘高峰.响应面分析法在中药提取和制备工艺中的应用[J].中药材，2010，33(10)：1651.

[7] 孟根达来，解红霞，谷福根.正交试验优选蒽酮-硫酸法测定蒙药“那仁满都拉”水溶性糖含量条件[J].中国药师，2015，18(7)：1106-1109.

[8] 汪瑞敏，朱秋劲，张春花，等.不同提取方法对天麻多糖抗氧化活性的影响[J].食品科技，2015，40(3)：208-213.

[9] 张梦娟，徐怀德，安兴国.天麻多糖的超声波提取工艺研究[J].西北农林科技大学学报，2007，35(4)：91-95.

[10] 康冰亚，刘瑞新，桂新景，等.Box-Behnken响应面法优化大蒜油提取工艺[J].中国药房，2017，28(1)：103-106.

[11] 朱洁平，李峰，深业寿.天麻多糖的提取工艺及含量测定研究[J].安徽农业科学，2012，40(18)：9648-9650.

[12] 朱晓霞，罗学刚.天麻多糖提取工艺优化[J].时珍国医国药，2007，18(4)4：906-907.

[13] 响应曲面法优化铁皮石斛多糖提取条件[J].中国现代中药，2011，13(9)：29-32.

[14] 刘涛，尼玛卓玛，尼珍，等.苯酚-浓硫酸法测定西藏天麻中多糖含量的条件优化[J].广东农业科学，2011(8)：132-134.

[15] 汪瑞敏，朱秋劲，张春花，等.不同提取方法对天麻多糖抗氧化活性的影响[J].食品科技，2015，40(3)：208-213.