周金星，钱兆全，靳二辉，刘文举，金光明，*

(1.安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100； 2.安徽科技学院 细胞与分子生物学研究中心，安徽 凤阳 233100)

胸腺是动物机体重要的淋巴器官，也是成熟T淋巴细胞形成场所，因此其功能状态与免疫密切相关。新生动物胸腺被摘除后，可发生细胞免疫缺陷[1]。中草药是我国的传统瑰宝，研究表明，许多中药制剂在促进胸腺生长发育、维持胸腺生理功能上具有重要作用。梁锐等[2]研究了军蛭煎剂可增加小鼠胸腺指数，改善其显微结构；连翘酯苷能改善由LPS诱导的AA鸡胸腺组织抗氧化功能的变化[3]；白术中的白术内酯Ⅰ能显著提高小鼠胸腺指数及T淋巴细胞增殖[4]；板蓝根凝集素可促进小鼠胸腺的发育和胸腺细胞的增殖[5]；黄芪建中汤可显著提高大鼠胸腺指数[6]；当归多糖对拮抗致衰剂对大鼠胸腺结构与功能具有很好的保护作用[7]；固本止咳中药可显著增加COPD模型小鼠胸腺指数[8]；红芪多糖-3可显著提高大鼠的胸腺指数[9]；猪苓和猪苓多糖可对BBN诱导的膀胱癌大鼠胸腺指数及功能具有较好的保护作用[10]。

Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是执行细胞凋亡最重要的一种蛋白酶[11]。对于胸腺中凋亡基因的研究，刘春雨等[12]报道了天府肉鸭发育过程中胸腺Bcl-2及Bax基因和蛋白的表达，姬松茸多糖可以抑制铅致大鼠胸腺凋亡基因Capase-3表达的增强[13]，从而保护胸腺功能。黄芪注射液可以通过下调Caspase-3表达，从而抑制胸腺T淋巴细胞凋亡，保护胸腺萎缩，增强胸腺功能[14]。但现有研究报道中，主要限于单味中药对胸腺Caspase-3蛋白的影响。周金星等[15]对炒白术、山楂、黄芪、板蓝根、茯苓、陈皮、甘草、山药等中药材按一定比例制成复方中药制剂，研究表明，其合理剂量可显著提高SD大鼠血清T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性和降低MDA含量的抗氧化功能，但该复方中药制剂对SD大鼠胸腺组织结构及其Caspase-3蛋白在大鼠胸腺中的分布未有报道，因此，本实验拟探究由上述8种中药制成的复方中药制剂对SD大鼠胸腺组织结构和Caspase-3蛋白的影响，为其复方中药制剂的开发利用提供研究资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康、体质量相似的断奶(25±2)d SD大鼠60只，全部为雄性，SPF级，购买于安徽医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK皖2011-002)。所有大鼠均饲养在SPF级环境中的全膜终端过滤式独立送风IVC笼具中，温度和湿度分别控制在24～28 ℃及50%～60%湿度，每天光照12 h。

1.2 复方中药制剂配制

实验用复方中药制剂由炒白术、山楂、黄芪、板蓝根、茯苓、陈皮、甘草、山药等按不同配比制成。组方配比后，分别添加复方中草药质量4倍的蒸馏水浸泡24 h，经水煮醇沉，浓缩后制成每mL水煎醇沉液相当于1 g生药材的复方中药制剂，备用。经青岛科标检测研究院对制备好的复方中药制剂检测鉴定，其主要成分含量为甘草苷82.44 mg·L-1，总多糖6.12 g·L-1，白术内酯3.67 mg·L-1，总黄酮0.047 g·L-1，总皂苷0.448 g·L-1。

1.3 实验动物分组

实验用SD大鼠60只，随机分成对照组、复方中药制剂1.5 mL·kg-1组、3.0 mL·kg-1组和6.0 mL·kg-1组，每组15只，预饲1 周后根据SD大鼠体质量每天分别灌胃1.5、3.0和6.0 mL·kg-1复方中药制剂，灌胃前3 h禁水禁食，定时称量，对照组按体质量同时灌胃蒸馏水3.0 mL·kg-1。

1.4 胸腺样品的采集与处理

实验开始后第90 天，各处理组SD大鼠禁食禁水3 h后，称量、麻醉、取完整胸腺组织称量后立即分割成小块投入到4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定72 h，经流水冲洗24 h，梯度酒精脱水，醇苯、二甲苯透明，浸蜡、包埋、切片、水浴锅展片、粘片、烤片后备用。

1.5 胸腺生长指数测定

胸腺生长指数为胸腺质量与大鼠体质量的比值。

1.6 组织切片染色

1.6.1 常规HE染色

将制作好的组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精清洗，苏木精与伊红染色后脱水、透明并封片，ZEISS正置荧光显微镜下观察不同实验组SD大鼠胸腺基本组织结构并摄影。

1.6.2 网状纤维染色

组织切片常规脱蜡至水，0.5%高锰酸钾染5 min，蒸馏水洗，2%草酸1 min，蒸馏水洗干净，2%铁明矾水溶液10 min，蒸馏水洗，放入银氨工作液作用15 min，10%福尔马林(中性)10 min，蒸馏水洗，5%硫代硫酸钠3 min，80%酒精、95%Ⅰ酒精清洗，95%Ⅱ、100%酒精Ⅰ、Ⅱ脱水各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明10 min，封片。ZEISS正置荧光显微镜观察各组大鼠胸腺中网状纤维分布并摄影。

1.6.3 免疫组织化学染色

切片常规脱蜡至水，蒸馏水、PBS先后浸泡5 min，浸泡于0.01 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液中，经微波炉高火加热煮沸后改用中火，并维持10～15 min，室温下自然冷却，PBS清洗3次。然后滴加3% H2O2阻断，PBS清洗3次。滴加封闭液，作用10～15 min，擦去封闭液，滴加一抗，在37 ℃湿盒中孵育2～3 h，PBS清洗。滴加二抗，37 ℃孵育15 min，PBS清洗3次后滴加三抗，37 ℃作用10～15 min，PBS清洗，DAB显色。苏木精复染，盐酸酒精分化，流水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。ZEISS正置荧光显微镜下观察SD大鼠胸腺中Caspase-3蛋白分布并摄影。

1.7 图片分析及数据统计

各实验组随机选择胸腺髓质部10个视野，利用Image-pro PLUS 6.0图像分析系统测定Caspase-3阳性表达的细胞，并计算阳性细胞面积百分比。实验数据采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，采用单因子方差分析法(one-way ANOVA)进行比较，以P值小于0.05作为差异显著性标准，实验数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 复方中药制剂对SD大鼠胸腺生长指数的影响

由图1可见，灌胃复方中药制剂90 d后，3.0 mL·kg-1组SD大鼠胸腺生长指数显著高于对照组(P<0.05)，1.5 mL·kg-1组和6.0 mL·kg-1组SD大鼠胸腺生长指数虽高于对照组，但与对照组比较差异不显著。

*表示组间差异显著(P<0.05)；**表示组间差异极显著(P<0.01)。下同。* indicated the significant difference between groups (P<0.05); ** indicated the extremely significant difference between groups (P<0.01); The same as below.图1 复方中药制剂对SD大鼠胸腺生长指数的影响Fig.1 Effect of compound Chinese medicine preparation on the thymus growth index of SD rats

2.2 复方中药制剂对SD大鼠胸腺基本组织结构的影响

通过HE染色观察SD大鼠胸腺基本组织结构可见，与对照组(图2-A)比较，灌胃复方中药制剂1.5 mL·kg-1和3.0 mL·kg-1组胸腺皮质区显著增加(图2-B，2-C)，髓质区较对照组变小，但灌胃复方中药制剂6.0 mL·kg-1组(图2-D)胸腺皮质区和髓质区与对照组比较变化不显著。

2.3 复方中药制剂对SD大鼠胸腺网状纤维的影响

通过Grimelius染色观察SD大鼠胸腺组织结构可见，SD大鼠胸腺网状纤维分布于胸腺髓质且交错成网状，皮质部的淋巴细胞功能区无网状纤维。与对照组(图3-A)比较，各实验组SD大鼠胸腺髓质部网状纤维含量均少于对照组，其中灌胃复方中药制剂3.0 mL·kg-1实验组(图3-C)髓质部网状纤维与对照组比较极显著减少，灌胃复方中药制剂1.5 mL·kg-1实验组(图3-B)与对照组比较髓质部网状纤维变化不显著，6.0 mL·kg-1实验组(图3-D)髓质部网状纤维略少于对照组。

2.4 复方中药制剂对SD大鼠胸腺Caspase-3蛋白分布的影响

通过Caspase-3免疫组织化学染色观察可见，SD大鼠胸腺中Caspase-3蛋白主要分布于胸腺的髓质部。与对照组(图4-A)比较，灌胃复方中药制剂3.0 mL·kg-1实验组(图4-C)Caspase-3阳性细胞显著减少，但灌胃复方中药制剂1.5 mL·kg-1实验组(图4-B)与对照组比较差异不显著，灌胃复方中药制剂6.0 mL·kg-1实验组(图4-D)与对照组比较阳性细胞减少。通过Image-pro PLUS 6.0图像分析系统测定Caspase-3阳性表达细胞面积百分比可见，复方中药制剂3.0 mL·kg-1实验组Caspase-3阳性细胞面积显著少于对照组(P<0.05)，1.5 mL·kg-1和6.0 mL·kg-1实验组较对照减少，但差异不显著(图5)。

A，对照组SD大鼠胸腺网状纤维；B，1.5 mL·kg-1组SD大鼠胸腺网状纤维；C，3.0 mL·kg-1组SD大鼠胸腺网状纤维；D，6.0 mL·kg-1组SD大鼠胸腺网状纤维；箭头表示网状纤维；Grimelius染色；标尺示20 μm。A，The reticular fiber of control thymus of SD rats; B，The reticular fiber of 1.5 mL·kg-1 thymus of SD rats; C，The reticular fiber of 3.0 mL·kg-1 thymus of SD rats; D，The reticular fiber of 6.0 mL·kg-1 thymus of SD rats; The arrow shows reticular fiber; Grimelius dyeing; Bar，20 μm.图3 复方中药制剂对SD大鼠胸腺网状纤维的影响Fig.3 Effect of compound Chinese medicine preparation on the thymus reticular fiber of SD rats

A，对照组SD大鼠胸腺Caspase-3蛋白分布；B，1.5 mL·kg-1组SD大鼠Caspase-3d蛋白分布；C，3.0 mL·kg-1组SD大鼠胸腺Caspase-3蛋白分布；D，6.0 mL·kg-1组SD大鼠胸腺Caspase-3蛋白分布；箭头表示Caspase-3蛋白阳性细胞；Caspase-3蛋白免疫组化染色；标尺示20 μm。A，The caspase-3 protein of control thymus of SD rats; B，The caspase-3 protein of 1.5 mL·kg-1 thymus of SD rats; C，The caspase-3 protein of 3.0 mL·kg-1 thymus of SD rats; D，The caspase-3 protein of 6.0 mL·kg-1 thymus of SD rats; The arrow shows caspase-3 protein positive cells; Caspase-3 protein immunohistochemical dyeing; Bar，20 μm.图4 复方中药制剂对SD大鼠胸腺Caspase-3蛋白的影响Fig.4 Effect of compound Chinese medicine preparation on the caspase-3 protein of SD rats

图5 复方中药制剂对SD大鼠胸腺Caspase-3阳性细胞面积比的影响Fig.5 Effect of compound Chinese medicine preparation on the area of Caspase-3 positive cells of SD rats

3 讨论

3.1 复方中药制剂影响SD大鼠胸腺组织结构

胸腺是动物机体重要的中枢免疫器官，主要功能是培育T淋巴细胞，并分泌胸腺素和胸腺生长素，随着动物的生长发育和日龄的增加，其功能会逐渐退化。因此，胸腺的生长指数和组织结构特点反映了胸腺的生长发育和功能状态，胸腺指数的高低同时也反映机体免疫功能的高低[16]。本研究结果表明，由炒白术、山楂、黄芪、板蓝根、茯苓、陈皮、甘草、山药等中药材按一定比例配制成复方中药制剂，其按体质量1.5、3.0和6.0 mL·kg-1灌胃SD大鼠90 d后，其胸腺指数较对照组都会提高，其中3.0 mL·kg-1组显著增加。通过组织结构观察可见，灌胃3.0 mL·kg-1剂量的复方中药制剂，其胸腺皮质部面积较对照组显著增加。由于胸腺皮质部主要含T淋巴细胞，因此，随着胸腺皮质部面积增加，T淋巴细胞在胸腺细胞中所占的比例相对增加，从组织学的角度证明SD大鼠按体质量灌胃3.0·kg-1复方中药制剂可改善胸腺的组织结构，延缓SD大鼠胸腺退化时间，从而增强胸腺的免疫功能。本复方中药制剂药液经青岛科标检测研究院检测分析，其总多糖成分高达6.12 g·L-1，研究表明，许多中药成分可提高胸腺的生长指数，拮抗衰老胸腺的功能[4-7，9-10]，所以，按体质量灌胃3.0 mL·kg-1复方中药制剂提高SD大鼠胸腺的组织结构和功能，其药液中含量较高多糖成分可能起到重要作用，但与复方中药制剂的用量不呈正相关。

网状纤维和胶原纤维、弹性纤维一样，属于结缔组织内的一种纤维类型，主要由网状细胞形成[17]。网状纤维穿梭于网状细胞的胞体和突起之间，与网状细胞共同形成支架，器官组织中网状纤维的分布状态和数量可以为器官的功能状态及病理变化提供重要参考，因此具有重要的意义[18]。本研究结果表明，SD大鼠胸腺网状纤维主要分布于胸腺髓质部，胸腺皮质少见或未见网状纤维。各实验组与对照组比较可见，髓质部网状纤维含量少于对照组，其中3.0 mL·kg-1组最显著，1.5 mL·kg-1和6.0 mL·kg-1组与对照组比较无显著变化。由于网状纤维的减少，可以减轻或避免胸腺组织的纤维化，对其正常功能行使和发挥具有重要意义。3.0 mL·kg-1复方中药制剂可显著减少网状纤维，从而可能在提高胸腺免疫功能上具有一定的参考意义。

3.2 复方中药制剂影响SD大鼠胸腺组织中Caspase-3蛋白的分布

Caspase-3蛋白是执行细胞凋亡的重要蛋白，胸腺是中枢免疫器官，其重要特点是随着年龄的增加其结构和功能都逐渐退化，研究表明，中药多糖可抑制胸腺中Caspase-3的表达，如黄芪注射液可以下调胸腺中Caspase-3表达来抑制胸腺T淋巴细胞的凋亡，从而保护胸腺的萎缩，增强胸腺的功能[14]。五味子多糖能够抑制环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡，降低胸腺细胞的损伤[19]。本研究中，复方中药制剂选用“扶正固本、清热解毒”类中药炒白术、山楂、黄芪、板蓝根、茯苓、陈皮、甘草、山药组成，结果表明，复方中药制剂3.0 mL·kg-1实验组Caspase-3阳性细胞面积显著少于对照组，说明在灌胃药液后，按体质量灌胃3.0 mL·kg-1剂量的药液可以抑制SD大鼠胸腺中Caspase-3蛋白的出现，从而对延缓胸腺的结构萎缩和功能退化有一定的保护作用。

综上所述，由炒白术、山楂、黄芪、板蓝根、茯苓、陈皮、甘草、山药等按一定比例配制的复方中药制剂对改善SD大鼠胸腺的组织结构，提高胸腺生长指数，减少胸腺中网状纤维的分布数量和抑制Caspase-3蛋白出现有较好的效果，其中以3.0 mL·kg-1剂量组最为显著。

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