郑艳青 史娜娜 曹存巍

(1.广西医科大学第一附属医院皮肤性病科，南宁 530021;2.南宁市第四人民医院，南宁 530023;3.广西艾滋病防治研究重点实验室，南宁 530021)

马尔尼菲篮状菌病 (talaromycosis marneffei，TSM)在东南亚、我国南方，尤其是广西、广东具有区域性流行[1]，TSM好发于免疫受损患者[2]，尤其是AIDS患者，据统计广西19%的AIDS患者合并T.marneffei感染，是仅次于结核的第二大机会性感染[3]。值得注意的是，近年来TSM在未合并基础疾病，细胞免疫功能未见异常的人群中发病数逐渐增多[4]。TSM病情隐匿，临床表现错综复杂，缺乏特征性，容易误诊和漏诊，若不早期诊断和及时治疗死亡率高 (超过80%)[5]。本研究组前期应用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR，qPCR)技术，设计出具有高度特异性的T.marneffei引物和Taqman探针，建立了稳定、高度特异、敏感、快速的检测体系。在初步临床检测中，55例首次采集的血清样本首次qPCR检测呈阳性，与真菌培养结果一致性高达100%，耗时比真菌培养确诊提前5～14 d，此方法有助于快速、特异性诊断TSM[6]。本研究基于前期研究结果，将临床样本扩展到病理切片、活检组织，期望从不同的临床样本中收集T.marneffei感染证据，为TSM的快速确诊提供坚实、可靠的证据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2017年1～6月期间，收集首次就诊于广西医科大学第一附属医院的5名HIV阴性TSM患者样本，包括肩部、臀部、前额、手背病理切片样本共5例，淋巴结活检组织样本1例。患者基本情况见表1。

1.2 方法

表1 TSM患者基本信息和临床表现

注：/.无合并症

1.2 方法

病理组织切片总DNA提取 将石蜡包埋的病理组织，切3～5薄片放入2 mL离心管中。加入1 200 μL二甲苯，涡旋震荡，20 000 g离心5 min，移去上清。往沉淀加1 200 μL无水乙醇，轻柔地震荡。20 000 g离心5 min，移去上清。重复用无水乙醇清洗1次。37℃开盖孵育10～15 min，直到酒精蒸发干净。加入180 μL的ATL缓冲液。按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒说明书提取组织总DNA。

淋巴结组织总DNA提取 取疑似TSM患者病变淋巴结，于生物安全柜中研磨破碎组织，用200 μL Buffer ATL重悬，将匀浆转移至1.5 mL离心管中，按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒说明书提取组织总DNA。

qPCR扩增[6]引物和Taqman探针序列：见表2。

Real-time PCR反应体系：2×Taqman universal PCR master mix 10 μL、5 μmol/L上下游引物和探针各1 μL，模板1～5 μL，无菌三蒸水补足20 μL。扩增体系：50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃ 1 min运行40个循环。设置已知浓度T.marneffeiDNA做阳性对照，白念珠菌DNA为阴性对照，反应终点读取达阈值荧光量的循环数

表2 qPCR 引物和探针序列

(Cq)。

2 结 果

上述实验操作至读取结果所需时间为3～4 h。如表3所示，皮肤病理切片、淋巴结活检组织qPCR检测结果阳性。淋巴结活检组织马尔尼菲篮状菌载量4.68×105copies，病理石蜡切片平均菌载量3.01×104copies (1.07×104～7.26×104copies)。

3 讨 论

T.marneffei主要侵犯人体单核吞噬细胞系统，可引起局限性感染和全身播散性感染，不同器官受累出现不同的临床表现，主要以发热，贫血，浅表及深部淋巴结肿大，肝脏和脾脏肿大，皮肤黏膜损害、溶骨性损害、呼吸道症状等为主，缺乏特异性[7]，导致TSM患者难以确诊，耽误早期治疗。邓卓霖等[8]报道TSM的病理改变与患者免疫状态有关，免疫力强的患者病变局限，T.marneffei较少，表现为慢性肉芽肿炎；具有一定免疫力的患者，表现为化脓性炎；而免疫功能低下的患者，病变组织中无或极少淋巴细胞存在，布满大量T.marneffei，表现为无反应性坏死性炎症，TSM患者临床表现个体差异大，尤其是免疫功能未见异常的患者，其临床表现不明显，容易漏诊、误诊。

表3TSM不同组织样本中T.marneffei菌载量

Tab.3Loads ofTalaromycesmarneffeiin different samples of TSM cases

编号标本来源Cq值总菌载量(copies)1左肩病理切片37．351．15×104右臂病理切片35．384．48×1042右上臀病理切片34．687．26×1043前额病理切片37．411．09×1044手背病理切片37．431．07×1045淋巴结活检组织31．964．68×105

目前，临床上诊断TSM以血标本、骨髓、痰液、活检组织等无菌样本的真菌涂片和培养作为金标准，病理学检查、血清学检测作为辅助诊断。TSM临床特点和病理学特征与结核分枝杆菌、荚膜组织胞浆菌感染非常相似，难于辨别[8-9]，T.marneffei与荚膜组织胞浆菌在感染组织中的大小、形态相似，染色相同，需要进行真菌培养才能鉴别。但是，真菌培养耗时长 (4～7 d)，不能满足临床快速诊断、早期治疗的迫切需求[10]。

血清半乳甘露聚糖 (GM)试验作为TSM病广泛的辅助诊断，具有便捷、快速、无创等优点，GM试验对PSM患者总体敏感度为78.38%，特异度为82.98%，但多种影响因素均可导致GM试验出现假阳性[11]。而T.marneffei未释放入血或释放入血后被迅速清除则会使GM试验出现假阴性，导致漏诊、误诊的情况。本研究旨在运用多种检测手段，从不同临床样本中收集T.marneffei感染证据，为临床诊断提供依据。

实时荧光定量PCR (qPCR)具有快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，成为病原分子生物学研究的重要工具，qPCR已经有效地运用在结核分枝杆、HCV、HIV、曲霉菌等病原微生物的诊断[12]。实验组前期首次建立了qPCR诊断TSM的方法体系，该方法特异性为100%，灵敏度高，最低检测限 (LOD)达到5～10拷贝数/反应。并在前期初步运用于临床血清标本的检测，患者首次采集的血清检测结果比真菌培养确诊提前了5～14 d，并且能够同时检测活菌或者死菌，甚至是游离在在血清中T.marneffei的基因组DNA[6]。

Tsunemi等[13]首次在1例患者皮肤活检组织中扩增出T.marneffei。Hanxiang Zeng等[14]运用巢式PCR成功检测出患者皮肤、肺组织石蜡切片中的T.marneffei。本实验收集TSM患者皮损病理切片或病变淋巴结组织，运用实时荧光定量PCR技术，准确地检测出皮损切片和淋巴结活检组织中T.marneffei载量，本实验方法具有快速、精确、定量、操作密闭性好的特点，直接检测样本中原始的菌载量，可直观反应病变组织遭受侵袭的严重程度。

有研究表明，TSM患者组织T.marneffei培养阳性率依次为：骨髓和淋巴结 (100%)、皮疹组织 (90%)、血液 (76%)。并且皮疹组织及皮疹分泌物培养出T.marneffei的时间比血液、骨髓、痰液时间更短[15。由此可见，皮疹在诊断T.marneffei感染方面有阳性率高、用时短的特点。病变组织是病原菌集中的地方，相比血液更容易检测到病原菌，适合用于早期分子诊断，为临床诊断提供强有力的证据。本研究成功运用qPCR检测到皮损切片中的T.marneffei载量，但是制作病理切片耗时长，工序复杂，不能满足临床快速诊断的迫切需求。继而本研究收集1例TSM患者淋巴结，直接提取组织DNA，qPCR检测呈阳性，T.marneffei载量高达4.68×105copies。结合国内外研究，qPCR直接测定活检组织中的菌载量可作为快速诊断TSM的重要方法。课题组将进一步对患者皮肤、淋巴、肺等活检组织进行研究，为临床诊断TSM提供更多、更可靠的证据，为早期治疗TSM争取时间。

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