谭东　庹德财　沈文涛　言普　黎小瑛　周鹏

摘 要 为研究番木瓜畸形花叶病毒（PLDMV）hc-pro基因保守基序FRNK对病症表现的影响，本研究采用定点突变的方法，获得了PLDMV-DF的hc-pro基因保守基序FRNK的精氨酸（R）突变为异亮氨酸（I）的突变体克隆p35S-PLDMV-GFP-R183/I，该位点突变显著减轻了PLDMV在番木瓜上的病症表现，表明是影响其致病性的关键位点。本研究结果为利用交叉保护防控番木瓜畸形花叶病毒病提供了重要参考和材料。

关键词 番木瓜；木瓜畸形花叶病毒；突变；侵染性克隆；症状表现

中图分类号 S668.2 文献标识码 A

Abstract To investigate the effect of the hc-pro gene conserved FRNK motif in Papaya leaf distortion mosaic virus （PLDMV）， we used the Hainan severe strain PLDMV-DF carrying a green fluorescent protein （gfp） gene as a model virus （denoted as p35S-PLDMV-GFP） to generate a mutant clone of p35S-PLDMV-GFP-R183/I， which contained the substitution of Ile for Arg at position 183 in the conserved FRNK motif of PLDMV，which could cause a dramatic symptom change from severe to mild in papaya. The site mutation significantly reduced the expression of PLDMV in papaya， indicating that it is the key point affecting its pathogenicity. The results of this study would provide important references and materials for cross-protection against papaya terato-mosaic virus disease.

Key words papaya； Papaya leaf distortion mosaic virus； mutation； infectious clone； symptom expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.018

番木瓜（Carica papaya L.）是海南重要的熱带经济果树，由于受病虫害等多种因素的影响，导致番木瓜产业的发展一直不景气。一直以来，番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是其最主要的限制因素[1]。转基因技术在番木瓜育种上的成功应用，对PRSV的防治具有重要意义，抗PRSV转基因番木瓜品种的得到大面积推广种植。但是海南番木瓜种植业面临着一种新的番木瓜畸形花叶病毒（papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）的威胁，且逐渐上升为主要病害[2-3]。PLDMV和PRSV同属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属病毒。目前，很难通过化学防治的方法对PLDMV进行防控，主要以清除病株及防治媒介昆虫为主。虽然台湾中兴大学已培育出同时抗PRSV和PLDMV的双抗转基因番木瓜[4]，但仍未见生产应用的相关报道。此外，由于各地区病毒株存在差异，导致一个地区的转基因植物在另一地区种植表现出的抗病能力减弱甚至抗性丧失，这使得目前这种利用病毒来源基因介导抗性的策略在生产应用上受到很大限制。且由于公众出于对转基因植物的生态风险和食品安全性的考虑，抗病毒转基因番木瓜的应用仍然受到极大地限制。因此，急需寻找广谱安全的抗病毒新策略。

PLDMV是单分体正义RNA（+ssRNA）病毒，基因组大小约10 kb（不包括poly A部分），由一个大的开放阅读框（ORF）和一个小的ORF组成，经加工共编码11个成熟蛋白（P1、HC-Pro、P3、6K1、PIPO、CI、6K2、Vpg、NIa-Pro、NIb和CP）[3]。HC-Pro蛋白是马铃薯Y病毒属病毒蛋白中研究最多的一个多功能蛋白，其命名来自首次鉴定出具有蚜虫传播的辅助成分（helper component，HC）功能，此外，HC-Pro蛋白还具有水解自身C端的半胱氨酸蛋白酶活性和RNA沉默抑制子等功能[4-5]。HC-Pro蛋白可分为N端（约100个氨基酸）、中间区域（约250个氨基酸）和C端（约100个氨基酸）3个结构区域，N端主要与蚜虫传播相关，C端主要具有蛋白酶水解活性，而中间区域是与RNA沉默抑制子等相关的多功能区[6-8]。目前有大量关于马铃薯Y病毒的hc-pro基因上的保守基序FRNK与致病性相关的研究报道[9-11]，当FRNK的R（精氨酸）突变为I（异亮氨酸）时会成为弱毒株，严重减轻在植株上的病症表现，且对强毒株具有较好的交叉保护效果。因此，本研究利用Gibson拼接法将PLDMV的hc-pro基因上的保守基序FRNK的精氨酸突变为异亮氨酸，获得在番木瓜植株上病症明显减弱的突变体克隆p35S-PLDMV-GFP-R183/I，为后续利用交叉保护策略防控PLDMV提供重要材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒源和供试植物 毒株PLDMV-DF（GenBank登录号：JX974555）由本实验室分离、保存，并构建了在nib/cp之间插入gfp基因的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-PLDMV-GFP[12]。本研究在非转基因番木瓜（Solo）植株上进行突变体克隆的鉴定。

1.1.2 菌株及载体 农杆菌C58C1（携带pSoup辅助质粒）由法国Thierry Candresse[13]实验室惠赠。构建突变体克隆的载体pGreenII-35S（登录号：KX826944）由本实验室构建并保存。

1.1.3 血清 PLDMV抗血清[14]由本实验室制备、保存。間接ELISA法检测PLDMV抗血清效价为1：10000。

1.1.4 主要试剂 高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max Premix、普通Taq酶Premix Taq（Taq Version 2.0）、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、反转录试剂盒PrimeScript ?? 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自TaKaRa公司；RNA提取试剂Trizol购自Thermo Fisher Scientific公司；Gibson Assembly Master Mix购自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计合成及测序 根据PLDMV-DF全长基因组序列、pGreenII-35S载体序列及突变位点，利用Verctor NTI advance II软件，设计Gibson拼接法构建PLDMV-DF突变体的引物（表1），引物合成和测序由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。

1.2.2 PLDMV-DF突变体的构建 本试验采用Gibson拼接法引入突变位点并快速构建其突变体侵染性克隆p35S-PLDMV-GFP-R183/I的方法[12]。具体构建步骤如下：以本实验室保存的在nib/cp之间插有gfp基因的PLDMV-DF（图1-A）侵染性克隆质粒p35S-PLDMV-GFP为模板，利用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max Premix，分别用引物对pldmv2121R/I-F、pldmv3R-30T和引物对pGr35S-pldF、pldmv2121R/I-R进行PCR扩增目的DNA片段a和b，PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段a和b。通过Gibson Assembly Master Mix 将片段a和b连接，电击法转化农杆菌感受态C58C1（含pSoup辅助质粒），然后进行挑取单克隆以及后续的PCR鉴定和测序验证。以提取的阳性克隆质粒为模板，利用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max Premix，分别用引物对pGreenII-F、pldmv6347R 和pldmv6322F、pGreenII-R将PLDMV-DF病毒全长基因组序列分为两个重叠约6 kb的DNA大片段P5和P3进行PCR扩增，胶回收大片段P5和P3后送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，测序引物见表1，测序结果进行Blast分析和利用Verctor NTI advance II软件进行拼接、比对分析。序列完全正确的R183/I突变体克隆即命名为：p35S-PLDMV-GFP-R183/I（图1-B）。

1.2.3 PLDMV-DF突变体接种番木瓜的病症观察及鉴定 将构建的PLDMV-DF突变体p35S-PLDMV-GFP-R183/I和对照组（阳性对照CK+为强毒株侵染性克隆p35S-PLDMV-GFP，阴性对照CK-为转化空载体pGreenII-35S的农杆菌克隆）分别农杆菌注射接种生长至20～30 cm 的非转基因番木瓜植株上，每组接种10株番木瓜苗，进行3次重复实验。农杆菌注射接种的方法主要参考Youssef等[15]的方法。接种后的番木瓜苗在温室中（25 ℃，光照12 h）培养，观察其生长情况并进行拍照。在农杆菌注射接种第30天和第60天，将整株苗用长波长（365 nm）的紫外（UV）灯（Black Ray B-100 A；Upland，CA，USA）进行观察拍照；在农杆菌注射接种第30天，取顶端第2片或第3片叶在荧光显微镜下观察发光情况，并对顶端第2片或第3片叶（非接种叶片，叶片长约1 cm为第1片叶），采用Trizol法提取番木瓜叶片总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA第一链，RNA提取和反转录具体操作参考其说明书。对cDNA模板用引物对pldmv1980F、pldmv2894R（表1）进行RT-PCR检测，并对其RT-PCR产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序分析，从而验证番木瓜植株感染的是否为接种的克隆。

1.2.4 间接ELISA检测病毒积累量 参照王振宇[16]的方法。其中酶标抗体为全式金辣根过氧化物酶羊抗兔，显色底物为DAB。

2 结果与分析

2.1 PLDMV-DF突变体克隆的构建

以质粒p35S-PLDMV-GFP为模板，PCR扩增获得目的片段 a和片段b，大小分别约为8.8、5.3 kb（图2-A），经Gibson拼接后转入农杆菌，经初步菌液PCR鉴定，从挑取的12个单菌落中鉴定出10个阳性克隆（图2-B）。然后从中挑取2个克隆进行质粒提取并进行质粒PCR鉴定，结果都获得目的大小片段，对其中一个克隆的2个大片段P5和P3进行测序（图2-C），经测序验证均正确，除在hc-pro基因的第183位由精氨酸（R）突变为预期的异亮氨酸（I）之外，PLDMV-DF的全长基因组序列上无碱基突变。结果表明：成功构建了hc-pro基因保守基序FRNK的精氨酸（R）突变为异亮氨酸（I）（R663→I）的突变体克隆p35S-PLDMV-GFP-R183/I（图1-B）。

2.2 弱毒突变体接种番木瓜的病症观察和鉴定

农杆菌注射法接种番木瓜后第30天，接种强毒株侵染性克隆p35S-PLDMV-GFP的阳性对照组（CK+），番木瓜顶端叶片开始出现轻微的褪绿和皱缩（图3-B），茎杆上有水渍状出现，而接种PLDMV-DF突变体克隆（p35S-PLDMV-GFP-R183/I）和阴性对照组（CK-）的番木瓜均未有明显症状（图3-B）。在UV灯下观察时，阳性对照组可见绿色荧光，主要表现在顶端嫩叶的叶脉和叶柄上（图3-A）；而接种PLDMV-DF突变体（p35S-PLDMV-GFP-R183/I）的番木瓜植株与阴性对照组一样，叶片和叶脉都观察不到绿色荧光（图3-A）。在荧光显微镜下观察时，阳性对照组的番木瓜叶片和叶脉可见很强的绿色荧光（图3-C），而接种突变体克隆（p35S-PLDMV-GFP-R183/I）的仅在局部叶片和叶脉上观察到很弱的绿色荧光（图3-C），而阴性对照组的番木瓜叶片观察不到绿色荧光（图3-C）。接种PLDMV-DF突变体（p35S-PLDMV-GFP-R183/I）和阳性对照组接种的番木瓜植株RT-PCR检测时，都有约915 bp目的条带（图4），PCR产物测序结果显示，突变体克隆（p35S-PLDMV-GFP-R183/I）能系统性侵染番木瓜，并能稳定的在子代病毒中遗传。

农杆菌注射60 d后，接种强毒株侵染性克隆p35S-PLDMV-GFP的阳性对照组（CK+），番木瓜嫩叶出现严重畸形，顶端出现停止生长，茎杆上有严重水渍状出现（图5-B～C），而接种PLDMV-DF突变体克隆（p35S-PLDMV-GFP-R183/I）在叶片上仍没有明显病症，但茎杆上有少量水渍状出现（图5-B～C），而接种阴性对照组（CK-）的番木瓜叶片和茎均没有明显病症（图5-B～C）。在UV灯下观察时，阳性对照组（CK+）的顶端叶片和叶柄上可见很强的绿色荧光（图5A）；而接种PLDMV-DF突变体（p35S-PLDMV-GFP-R183/I）的番木瓜植株与阴性对照组一样，叶片和叶脉都观察不到绿色荧光（图5-A）。其中，3次独立重复实验数据（表2）结果显示，阳性对照组（CK+）的侵染性高达90%以上，p35S-PLDMV-GFP-R183/I的侵染性也达到80%以上。

2.3 弱毒株突变体侵染番木瓜病毒积累量分析

ELISA结果表明（图6），p35S-PLDMV-GFP-R183/I接种番木瓜中30 d时，PLDMV CP积累量远低于阳性对照组（CK+）。在接种60 d时，阳性对照组（CK+）的番木瓜叶片中CP的积累量明显比接种30 d时检测值高，而p35S-PLDMV-GFP-R183/I的番木瓜叶片中CP积累量与接种60 d检测值相比略有一点增长，但仍远低于阳性对照组（CK+），且与阴性对照组（CK-）的检测值接近。

2.4 PLDMV-DF致病力相关位点分析

将5个PLDMV全长氨基酸序列与64个马铃薯Y病毒属病毒的全长氨基酸序列进行多序列比对分析，结果显示：hc-pro基因上的FRNK基序在69个马铃薯Y病毒属病毒中均非常保守（图7）。而本实验中将PLDMV-DF的hc-pro基因上第183位精氨酸（R）突变为异亮氨酸（I）时，会减轻在番木瓜上的病症，且延迟发病，可见FRNK保守基序与病毒致病性相关，当精氨酸突变为异亮氨酸时会严重影响其致病力。

3 讨论

hc-pro基因是马铃薯Y病毒属病毒中研究最多的一个多功能基因，主要参与蚜虫传播、抑制基因沉默、病毒运动、病症表现等功能[7]。研究报道了hc-pro基因上的保守基序FRNK与致病性、小RNA结合及症状发生等紧密相关[9-10， 17-19]。ZYMV的保守基序FR180NK人工突变为FI180NK时，可獲得病症明显减轻的台湾ZYMV弱毒株GAC和以色列弱毒株AG，且对ZYMV强毒株均有较好的交叉保护效果[9-10]。还有研究表明，将马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的hc-pro中的基序FRNK突变为FINK后，hc-pro丧失了抑制RNA沉默的活性[16]。同样在烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）上证明，FRNK（X）12CDN基序的突变都能影响hc-pro的抑制RNA活性[20]。本实验室在番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）的弱毒株构建中验证了R728是决定PRSV-LM致病性和病症表现的关键位点[21]。此外，进一步研究了保守基序FRNK的功能可能涉及到小RNA途径，从而影响其致病性和病症发生[17-19]。本研究将PLDMV-DF的hc-pro基因上的保守基序FR183NK突变为FI183NK，获得了在番木瓜上病症显著减弱的突变体p35S-PLDMV-GFP-R183/I，可作为弱毒株用于后续交叉保护防控PLDMV的研究，同时证实保守基序FRNK的R位点也是影响PLDMV-DF致病性和症状表现的关键位点。

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