陈志磊　安凤杨　刘笑宇　刘欢　郭云然　于海琦

[摘要]目的：分析与探讨燃煤型砷中毒患者中抑癌基因p1 6突变与甲基化的情况及意义。方法：选取120例2013年4月-2015年5月在我院收治的燃煤型砷中毒患者，依照皮肤病变病理学诊断结果，将所有患者分为癌前组（24例）、癌病组（20例）及普通病变组（76例），通过PCR与PCR-SSCP产物克隆测序检测突变热点显子，并通过甲基化内切酶分析第1外显子。结果：通过PCR与PCR-SSCR产物克隆测序对燃煤型砷中毒病人外周血DNA进行分析，没有检测出抗癌基因p16第2外显子发生突变。通过SmaI酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA后，癌变组患者中，扩增出抗癌基因p16第1外显子片段4例，普通病变组与癌前组患者没有检测出SmaI位点甲基化情况。结论：研究表明，p16基因由于高度甲基化是造成p16基因在砷性肿瘤中失活的关键方式，而且在砷致癌中发挥着重要作用。

[关键词]抑癌基因p16；燃煤型砷中毒；突变；甲基化

1资料与方法

1.1一般资料

选取120例2013年4月-2015年5月在我院收治的燃煤型砷中毒患者，其中92例男性，28例女性，年龄为19-60岁，平均年龄为（47.2±4.5）岁。依照皮肤病变病理学诊断结果，将所有患者分为癌前组（24例）、癌病组（20例）及普通病变组（76例）。三组患者临床资料差异性不明显，P>0.05，不具有可比性。

1.2仪器与试剂

所用试剂为dNTP、Taq DNA聚合酶、内切酶SmaI以及电泳用琼脂糖，以上试剂均为上海TaKaRa公司提供。所选仪器为全自动紫外分光光度计、电泳仪等。

1.3提取DNA

空腹采取患者2ml静脉血，并行EDTAK2抗凝，采用酚氯仿法对基因组患者DNA进行抽提，紫外分光光度计实施定量，将其稀释到大约100ng/ul，在-20℃环境下保存。

1.4 PCR-SSCP

通常p16基因点在第2外显子发生，而且由于第2外显子相对比较大，通过两对引物实施扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定后，去PCR产物5ul，再加入SSCP缓冲液（5u1）混匀。

1.5甲基化分析

通过内切酶Sinai实施DNA酶切，并在30～C环境下进行16h的消化，65℃环境下灭活大约20mm，将消化完成的DNA当作模板，并对p16基因第一外显子进行扩增，CG甲基化将这种酶切作用阻断，若DNA通过SmaI消化后依旧可以向第一外显子扩增，表示这种基因SmaI位点甲基化。

1.6统计学处理

采用SPSS16.0软件进行统计学处理，）（2检验数据分析，P<0.05表示差异性比较明显，具有统计学意义。

2结果

2.1抗癌基因p16第2外显子突变检测结果

通过PCR与PCR-SSCR产物克隆测序对燃煤型砷中毒病人外周血DNA进行分析，没有检测出抗癌基因p16第2外显子发生突变。

2.2分析抗癌基因p16第1外显子甲基化结果

通过SmaI酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA后，癌变组患者中，扩增出抗癌基因p16第1外显子片段4例，普通病变组与癌前组患者没有检测出SmaI位点甲基化情况，见表1。

3讨论

抑癌基因p16是近年来所研制的一种在细胞分裂中直接作用的一种基因，抑癌基因p16主要参与肿瘤病变发生及发展，其中的抑制细胞p16和视网膜细胞瘤基因、p53基因、细胞周期素依赖性集美以及细胞周期素等组成周期细胞反馈调节环，对人体细胞周期具有调控作用。本研究通过PCR、PCR-SSCP产物克隆测序检测突变热点显子，没有检测出突变现象。并通过甲基化内切酶分析第1外显子，研究结果发现，通过SmaI酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA后，癌变组患者中，扩增出抗癌基因p16第1外显子片段4例，普通病变组与癌前组患者没有检测出SmaI位点甲基化情况。砷是一种致癌物质，在生物机体与外在环境中均存在甲基化代谢转换过程，采用甲基化的方式降低砷的毒性，然而，因为砷转化途径类似于DNA甲基化，很可能会导致抑癌基因或者原癌基因甲基化模式发生变化，具有致癌作用，而p16基因由于高度甲基化是造成p16基因在砷性肿瘤中失活的关键方式，而且在砷致癌中发挥着重要作用。