赵留杰，王 元，常晓晴，房文红，陈进军，方金龙

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

异育银鲫（Carassius auratus gibelio）是我国重要的大宗淡水养殖品种之一，在我国淡水养殖业中具有重要地位。但近年来，由于养殖密度不断增大等原因，异育银鲫养殖遭遇到多种病害的侵袭，尤其是粘孢子虫，可寄生于异育银鲫的鳃、表皮、喉部、肠、肝等部位，其造成的危害已给产业带来重大经济损失［1］。盐酸氯苯胍（robenidine hydrochloride，ROBH）广泛用于鸡、兔球虫病的防治，其作用机理主要是干扰虫体胞浆内质网，影响虫体蛋白质代谢，使内质网的高尔基体肿胀，氧化磷酸化反应和ATP酶被抑制［1－2］。在2010年的农业部1435号公告中正式被列为国标渔药，用于水产养殖中防治鱼类的孢子虫病［4］。药动学和药物消除规律研究是制定用药方案和休药期的基础。目前，盐酸氯苯胍药动学和残留消除的研究主要集中在鸡、兔等动物［5－7］，在水产动物体中仅红笛鲷（Luthjanus sanguineus）有见报道［3］，检测方法主要有高效液相色谱法［5，8］、液质联用法［6－7，9－12］等。然而，盐酸氯苯胍在缺乏药物代谢和消除研究的基础下大量用于异育银鲫粘孢子虫病防治，对于药物能否突破血脑屏障到达靶组织及在可食组织中的残留情况均不清楚，这既不利于药物治疗，也对水产品质量安全构成一定的风险。我国水产养殖种类繁多，而国标渔药中规定的用药方案和休药期十分笼统，并未考虑鱼虾蟹等不同水产动物之间的差异，亟需更多研究来指导药物的合理有效使用［13］。本文研究了单剂量药饵给药盐酸氯苯胍在异育银鲫体内药动学和盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的吸收、分布、代谢过程，以及在肝胰脏、肌肉、喉、肾脏、肠、鳃、脑和胆汁中的分布和消除规律，以期为药物的安全有效使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

盐酸氯苯胍 （robenidine hydrochloride，ROBH）标准品（纯度≥99.5%），购自 Sigma公司；盐酸氯苯胍原药（纯度≥98.0%），购于浙江汇能生物股份有限公司；甲醇和乙腈（HPLC级），均购自德国默克公司；肝素钠和甲酸等（分析纯），购自国药集团上海化学试剂公司。

1.2 仪器和设备

高效液相色谱仪（Waters 2695，美国）；紫外检测器（Waters 2487，美国）；色谱柱为 Aglient Zorbax SB-C18（4.6×150 mm，5μm）（Aglient，美国）；组织研磨仪（SKSI，必横，中国上海）；超纯水仪（Millipore Milli-Q Advantage，美国）；电子分析天平（Mettler Toledo AL204，感量 0.000 1 g，瑞士）；旋转蒸发器（RE-52A，亚荣，中国上海）；高速冷冻离心机（HITACHI CF16RXⅡ，日本）；微量移液器（Eppendorf，德国）；0.22μm针式过滤器（Anpel，安谱，中国上海）。

1.3 实验动物

本次实验模拟水产养殖生产采用投喂药饵进行给药，实验用异育银鲫购自上海青浦某养殖场，鱼体质量（130±20）g，暂养于5 m×3 m×1 m的水泥池，保持24 h充气并及时排出粪便和残饵。实验期间水质的基本参数为：水温（25±1）℃，水体 pH 7.74±0.06，氨氮（0.40±0.03）mg·L－1，亚硝氮（0.055±0.012）mg·L－1。投喂人工配合饲料，每日2次（上午8∶00和下午16∶00），每次按照鱼体重1.5%的投饵率驯化鲫吃食，投喂时间保持在20 min内，暂养2周后用于实验，实验期间异育银鲫成活率为100%。

1.4 给药和样品采集

按20 mg·kg－1鱼体重的剂量单次投喂含盐酸氯苯胍的药饵，药饵投喂后在15 min内全部被摄食。采样时间点为在药饵被全部摄食后1、2、4、6、8、12、24、48、72、120、192、288、384、480、600 h和720 h，每个时间点随机采集6尾鲫。每条鱼尾静脉采血取1 mL血液置于预先装有肝素钠抗凝剂的2 mL离心管中，振荡混匀后于8 000 r·min－1下离心5 min，取上层血浆于－80℃保存备用。同时在冰浴上迅速采集肝胰脏、肌肉、喉、肾脏、肠、鳃、脑和胆汁于－80℃保存备用。

1.5 样品前处理

参考刘勇军等［5］的处理方法，选用乙腈作为提取剂。血浆样品于室温融解后，摇匀，吸取400 μL置于2 mL离心管内，加入400μL乙腈，旋涡混合仪剧烈混合2 min，于12 000 r·min－1转速离心5 min，吸取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，用于HPLC分析。

其它组织样品于室温解冻后，肌肉、肝胰脏和肠称取1.00 g，喉、肾脏和鳃称取0.50 g，脑和胆汁分别取2个样品混合为一个检测样品称取0.50 g。样品置于10 mL离心管中，加入5 mL乙腈及适量不锈钢珠于均质器中均质（条件：65 hz，100 s）；于9 000 r·min－1转速离心5 min，收集上清液；残渣再重复提取两次，合并3次上清液于100 mL具塞茄形蒸发瓶中，于45℃、真空度0.075 Mpa下旋蒸至干；先加入1 mL流动相再加1 mL正己烷，盖上塞子置超声波清洗仪超声3 min，瓶底残留物完全溶解，将混合液体转移至2 mL离心管中，12 000 r·min－1离心5 min，吸取下层液体，经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC分析。

1.6 色谱条件

流动相为：乙腈：0.1%甲酸水 ＝55：45（V／V），柱温30℃，流速 1.0 mL·min－1，进样量 20 μL，紫外检测波长317 nm。

1.7 标准曲线和检测限

配制浓度分别为10μg·mL－1、5μg·mL－1、2μg·mL－1、1μg·mL－1、0.5μg·mL－1、0.2μg·mL－1、0.1μg·mL－1、0.05μg·mL－1、0.01μg·mL－1盐酸氯苯胍溶液，过滤膜后上样，记录峰面积，以盐酸氯苯胍浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。

1.8 回收率和精密度测定

在血浆、肝胰脏、肌肉、喉、肾脏、肠、鳃、脑和胆汁组织样品中添加标准品，使组织中药物浓度分别为0.10μg·g－1、1.0μg·g－1和 10μg·g－1。每个浓度6个平行，混匀后静置20 min，按“样品前处理”方法处理。

1.9 数据处理

药饵给药下异育银鲫血药浓度－时间关系曲线方程采用房室模型进行拟合分析，血浆的药动学参数也由房室模型推算。肝胰脏、肌肉、喉、肾脏、肠、鳃、脑和胆汁的药动学参数采用统计矩原理推算。模型的拟合和药动学参数的推理采用上海中医药大学药物临床研究中心的DAS 3.1药物与统计软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 实验方法验证

2.1.1 线性范围和检测限

盐酸氯苯胍在0.01～10μg·mL－1范围内建立的标准曲线线性关系良好，标准曲线回归方程为y＝60 242x，R2＝0.999 8。以 3倍信噪比计算，检测限为0.01μg·mL－1。

2.1.2 回收率及精密度

采用加标法测定异育银鲫各组织中盐酸氯苯胍回收率，各组织的盐酸氯苯胍回收率都较高，均在80%以上，血浆则大于95%；精密度由相对标准偏差（RSD）表示，相对标准偏差为2.16%～7.41%，说明样品处理方法稳定，重现性好，可满足各组织中样品的检测要求。

2.2 药饵给药后血浆中盐酸氯苯胍药动学

2.2.1 药饵给药后血浆中盐酸氯苯胍浓度－时间曲线关系

20 mg·kg－1盐酸氯苯胍药饵给药后，异育银鲫血浆中药物浓度与时间关系曲线见图1。给药后血浆中盐酸氯苯胍浓度快速升高，4 h达到最高，峰浓度（Cmax）为 1.117 mg·L－1；随后开始快速下降，12 h已经降低到0.310 mg·L－1，接近于峰浓度的1／4，之后进入缓慢消除阶段；192 h已经低于0.1 mg·L－1，600 h时血药浓度接近方法的检测限 0.01 mg·L－1。

2.2.2 药饵给药后盐酸氯苯胍在血浆中的药代动力学参数

采用房室模型对血浆中盐酸氯苯胍浓度与时间关系曲线进行拟合，血药浓度－时间关系曲线适合采用一级吸收二室模型来描述，拟合的药动学方程为：

Ct＝0．169e－0．213t＋7．828e－0．211t－8．016 e－0．306t（R2＝0.956）

用房室模型对血浆药物浓度与时间关系进行药动学分析，所得参数见表1。

图1 ROBH药饵给药后异育银鲫血浆中药物浓度－时间关系曲线（n＝6）Fig.1 Profile of ROBH concentrations in plasma following oral administration of medicated-feed during 0－720 h（n＝6）

表1 盐酸氯苯胍在血浆中的药代动力学参数（n＝6）Tab.1 Pharmacokinetic parameters of ROBH in plasma after oral dosing via feed（n＝6）

2.3 药饵给药后组织中盐酸氯苯胍分布与消除规律

2.3.1 药饵给药后组织中盐酸氯苯胍浓度－时间曲线关系

药饵给药后，异育银鲫组织中药物浓度与时间关系曲线见图2。肌肉、喉、肾脏、脑、鳃和胆汁的浓度变化趋势与血药相似，但组织中盐酸氯苯胍峰浓度和达峰时间明显不同，药物峰浓度分别为 0.431 mg·kg－1、1.170 mg·kg－1、4.641 mg·kg－1、0.824 mg·kg－1、1.383 mg·kg－1和 2.681 mg·kg－1，达峰时间分别为 4 h、8 h、2 h、4 h、4 h和4 h；肝胰脏和肠的浓度变化趋势相似，药物峰浓度分别为 3.270 mg·kg－1和 8.529 mg·kg－1，达峰时间均为1 h。

2.3.2 药饵给药后盐酸氯苯胍在组织中的药代动力学参数

采用统计矩原理求得异育银鲫肝胰脏、肌肉、喉、肾脏、肠、鳃、脑和胆汁等组织药动学参数，见表2。盐酸氯苯胍在异育银鲫组织中分布较广，Cmax大小依次为：肠、肾脏、肝胰脏、胆汁、鳃、喉、脑和肌肉；AUC0－∞大小依次：肠、肾脏、胆汁、肝胰脏、喉、鳃、脑和肌肉；t1／2z大小依次为：脑、鳃、肾脏、喉、肝胰脏、胆汁、肌肉和肠。

3 讨论

3.1 盐酸氯苯胍在异育银鲫血浆中的药动学

图2 ROBH药饵给药后异育银鲫组织中药物浓度－时间关系曲线（n＝6）Fig.1 Profile of ROBH concentrations in tissues following oral administration of medicated-feed during 0－720 h（n＝6）

表2 药饵给药后异育银鲫各组织中盐酸氯苯胍药动学参数（n＝6）Tab.2 Pharmacokinetic parameters of ROBH in Carassius auratus gibelio after oral dosing via feed（n＝6）

本研究中，采用了房室模型对血药浓度－时间关系曲线进行拟合分析，血浆中盐酸氯苯胍浓度－时间关系曲线均能很好地采用一级吸收二室开放模型来描述。有关盐酸氯苯胍在动物体内药动学的报道较少。李强等［7］完成的盐酸氯苯胍在兔体内的药动学及生物利用度研究包括一组以2.00 mg·kg－1单次静脉注射给药，另一组以100.00 mg·kg－1单次内服给药。数据表明该药静脉注射后表观分布容积较大，表示药物大部分分布于组织，且消除迅速；该药物的绝对生物利用度仅为7.36%，说明内服盐酸氯苯胍后，药物基本不吸收，而是主要以原型排出体外。此外，盐酸氯苯胍2种给药方式的各药动学参数均存在极显著差异（P＜0.01）。汤菊芬等［3］关于盐酸氯苯胍在红笛鲷体内的药代动力学及残留消除规律的研究结果显示，单剂量30 mg·kg－1口灌给药后，红笛鲷血浆中盐酸氯苯胍的药时数据符合一级吸收二室模型，药物在血－浆中的达峰时间Tmax为1.79 h，血药浓度峰值Cmax为 211.38 μg·L－1、药时曲线下面积（AUC0－∞）为 5 229.16 μg·（L·h）－1、表观分布容积 Vz为 78.69 L·kg－1、消除半衰期（t1／2β）为 46.99 h。其血浆和组织中的药时曲线均出现明显的双峰现象，作者认为引起该现象的主要原因是肝肠循环和非齐性吸收。在本研究中，盐酸氯苯胍以20 mg·kg－1单剂量药饵给药后，血浆中盐酸氯苯胍浓度快速升高，4 h达到最高，峰浓度（Cmax）为1.117 mg·L－1，药时曲线下面积（AUC0－∞）为 68.39 mg·L－1·h，表观分布容积 Vd为 44.064 L·kg－1、消除半衰期（t1／2β）为 56.86 h。两者的血药浓度峰值和药时曲线下面积数值均不是很高，这可能与两个实验的表观分布容积（Vd）有关：Vd是反应药物在体内的分布情况，Vd值越大，药物穿透入组织越多，分布越广，血药浓度越低。两者的消除半衰期数值接近，表明盐酸氯苯胍在红笛鲷和异育银鲫的血浆中的消除速度相近。

3.2 盐酸氯苯胍在异育银鲫组织中的分布与治疗鱼类寄生虫病的联系

分析给药后水产动物组织中药物浓度，有利于全面了解药物在动物组织中的分布和消除规律，为制定合理给药方案和休药期提供理论依据。汤菊芬等［3］关于盐酸氯苯胍在红笛鲷体内的药代动力学及残留消除规律的研究结果显示，单剂量30 mg·kg－1口灌给药后，盐酸氯苯胍在红笛鲷体内组织中药动学参数Cmax大小依次为：肾脏、肝脏、肌肉；AUC0－∞大小依次为：肾脏、肝脏、肌肉。说明盐酸氯苯胍口灌给药时在红笛鲷体内吸收较为缓慢，药物多分布于肝脏和肾脏，血浆和肌肉中分布较少。t1／2和MRT0－∞是反映药物在动物体内消除快慢的重要参数。t1／2依次为：肌肉、肾脏、肝脏，MRT0－∞依次为：肌肉、肾脏、肝脏，说明盐酸氯苯胍主要分布于肾脏和肝脏，在肌肉中平均驻留时间最长，消除半衰期明显高于肾脏和肝脏。

在本研究中，经过单剂量20 mg·kg－1盐酸氯苯胍药饵给药后，采集了异育银鲫的多个组织进行药动学分析。肠的 Cmax（8.53 mg·kg－1）和AUC0－∞（156.39 mg·kg－1·h）均为各个组织中最大值，而 t1／2z（48.581 h）与 MRT0－∞（53.636 h）均为各个组织中最小值，说明盐酸氯苯胍经鲫摄食后，首先通过肠道消化吸收。肾脏的 Cmax（4.64 mg·kg－1）、AUC0－∞（122.911 mg·kg－1·h）和 t1／2z（76.541 h）仅次于肠道，且 MRT0－∞（81.953 h）为小于肝胰脏的较大值，说明盐酸氯苯胍主要是经鲫的肾脏排出体外。肝胰脏的Cmax（3.27 mg·kg－1）和 AUC0－∞（68.444 mg·kg－1·h），胆汁的 Cmax（2.68 mg·kg－1）和 AUC0－∞（83.772 mg·kg－1·h），两者的参数较为接近且均为各个组织中的较大值，说明肝胰脏和胆都是盐酸氯苯胍在鲫体内的主要代谢器官。鳃的Cmax（1.38 mg·kg－1）和 AUC0－∞（39.142 mg·kg－1·h）虽然远小于肠、肾脏、肝胰脏和胆汁，但是要大于肌肉和脑，t1／2z（83.263 h）和 MRT0－∞（93.532 h）仅次于脑，说明盐酸氯苯胍在鳃中药物分布并不多，但是持续存在时间较长，鳃可能是鲫的次要排泄器官。喉组织中的 Cmax和AUC0－∞均处于血浆和鳃之间，t1／2z与 MRT0－∞也处于各组织的中间水平，说明盐酸氯苯胍在喉中具有良好的分布，推测这与喉组织具有较为丰富的血液供给有关。肌肉的Cmax和 AUC0－∞是各个组织中的最小值，t1／2z仅大于肠，说明盐酸氯苯胍在肌肉中分布较少且消除较快，不会长时间残留于组织中，可以拥有较短的休药期。脑组织的Cmax和AUC0－∞表明盐酸氯苯胍能少量透过血脑屏障［14］进入异育银鲫脑组织，而脑的 t1／2z与MRT0－∞的数值均为最大的，说明药物在脑中的消除最慢。比较分析各组织器官的药动学参数，说明盐酸氯苯胍经鲫摄食后，经血液循环广泛分布于组织中，大多数药物进入肾脏、肝胰脏和胆等进行代谢并排出体外，这也与其较大的Vd值相印证。

在水产养殖生产中，盐酸氯苯胍已被广泛运用到防治鱼类寄生虫病，尤其是鱼类的孢子虫病，并取得了较好的治疗效果。鲫粘孢子虫病是鲫养殖区发生最为严重的一种病害，主要危害鲫1龄鱼种和成鱼。孢子虫主要寄生于鲫的鳃、鳞、鳍、吻、喉、肠、肝、肌肉和脑等部位［1］。其中以寄生在喉部所引起的孢子虫病危害最为严重，主要症状是在鱼体的咽喉部位形成一个比较大的胞囊，因为直接影响到鱼体呼吸和摄食，所以经常引起养殖鲫较高的死亡率。在本研究中，经过单剂量20 mg·kg－1盐酸氯苯胍药饵给药后，孢子虫的主要病灶鳃、喉、肠、脑和肝胰脏中，均有较高的Cmax和AUC0－∞，保证有效的药物进入到病灶，t1／2z和 MRT0－∞保证了药物与孢子虫的作用时间，理论上是可以达到较好的治疗效果。但是此药物能否通过孢子虫的孢壁尚不清楚，还需要更为深入的研究。脑组织的Cmax和AUC0－∞表明盐酸氯苯胍可以透过血脑屏障进入脑组织，而脑的t1／2z与 MRT0－∞的数值均为最大的，说明药物在脑中的消除最慢。这一方面预示盐酸氯苯胍可以应用于异育银鲫脑部寄生虫疾病的治疗，另一方面也提示在临床使用盐酸氯苯胍时应考虑其中潜在的风险（例如神经毒性），实际生产中发生的盐酸氯苯胍药物中毒事件也印证了这个问题［15］。本研究对江苏地区的淡水大规模养殖品种异育银鲫的多个组织进行了药动学和残留消除研究，获得了较为全面的数据，这些实验数据对该药物在生产中的科学使用提供了依据和参考。

3.3 盐酸氯苯胍在异育银鲫组织中的残留消除和休药期

班付国等［6］所作的氯苯胍在鸡组织中的残留消除规律研究，以含氯苯胍500 mg·kg－1饲料饲喂 7 d，停药后的第 0、1、3、5、7天取其肌肉、肝脏、肾脏、皮和脂肪5种组织。结果表明，氯苯胍在肌肉中残留量较小，代谢消除比较快；而在脂肪、皮和肝脏中残留量较大，代谢消除较慢。汤菊芬等［3］关于盐酸氯苯胍在红笛鲷体内的药代动力学及残留消除规律的研究结果显示，连续5 d口灌给药后，红笛鲷组织中的药物残留浓度大小依次为：肾脏、血浆、肝脏、肌肉。消除半衰期t1／2大小依次为：肌肉、肝脏、肾脏、血浆，说明盐酸氯苯胍在红笛鲷肌肉中消除最慢。盐酸氯苯胍主要分布于肾脏和肝脏，在肌肉中平均驻留时间最长，消除半衰期明显高于肾脏和肝脏。本研究中，经过单剂量盐酸氯苯胍药饵给药后，异育银鲫体内组织Cmax大小依次为：肠、肾、肝胰脏、胆、鳃、喉、脑、肌肉；t1／2z大小依次为：脑、鳃、肾、喉、肝胰脏、胆汁、肌肉、肠。肌肉的Cmax最小，虽然其t1／2z较高，但是由于较低的药峰浓度，经过较短的时间，依然可以降低到较低残留量。盐酸氯苯胍在异育银鲫肌肉、肝脏、肾脏的消除半衰期和平均驻留时间均大于红笛鲷的相应组织，说明盐酸氯苯胍在海水性鱼类红笛鲷体内的代谢和消除速度快于淡水性鱼类异育银鲫，这可能与它们所处不同盐度的水环境有关。

目前，国内外均制订了盐酸氯苯胍在部分动物源食品中的最高残留限量。2002年，我国农业部规定盐酸氯苯胍在鸡脂肪、皮及其它可食用组织中的最高残留限量分别为 200、200、100μg·kg－1［16］。2012年，美国《联邦规章典集》（Code of Federal Regulations，CFR）第21篇“食品与药品”（title 21-food and drugs）中的关于盐酸氯苯胍在鸡脂肪、皮及其它可食用组织中的最高残留限量规定与我国相同［17］。但中国、美国和欧盟等对水产品中盐酸氯苯胍暂无明确的残留限量要求［18］。随着盐酸氯苯胍在水产养殖中的大量使用，也对水产品质量安全构成一定的风险，因此必须严格制定盐酸氯苯胍的最高残留限量和休药期。盐酸氯苯胍是我国第一批正式转为国家标准的杀虫驱虫渔药，休药期规定为500度日［19］。2006年日本实施的肯定列表制度，要求对于未制定最大残留限量标准的农业化学品在食品中含量不得超过 10μg·kg－1的规定［20］。本研究若以 100 μg·kg－1作为盐酸氯苯胍在异育银鲫肌肉中的最高残留限量，在停药后24 h，已低于设定的最大残留限量。若以10μg·kg－1作为盐酸氯苯胍在异育银鲫肌肉中的最高残留限量，在停药后288 h，已低于设定的最大残留限量。但鉴于本研究是单次给药而实际生产中大多为疗程多次用药，且本次实验未检测鱼皮中的药物含量，以及考虑到药物在水产养殖体内消除受养殖环境、健康状况、水温等因素的影响，为保证消费者的安全，应将休药期适当延长。因此，在本实验条件下，若以10μg·kg－1作为盐酸氯苯胍在异育银鲫肌肉中的最高残留限量，建议盐酸氯苯胍在异育银鲫体内的休药期至少为15 d，这与国家标准渔药在25℃温度下20 d的休药期规定接近。

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