张 翼，姜亚洲，徐开达，蒋宏雷，焦海峰，张 辉，程家骅，李圣法

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；

2.浙江省海洋水产研究所，农业部重点渔场渔业资源科学观测实验站，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021；3.宁波市海洋与渔业研究院，浙江宁波 315012）

增殖放流苗种标记作为开展增殖放流功效评估的重要基础，也是制约功效评估精度的关键因素［1］。现阶段，依据增殖放流物种的生物生态学特征，结合增殖放流功效评估的具体需求，研建生态高效的增殖放流苗种标记方法已成为增殖放流基础科研领域的重要内容［2－3］。黑鲷（Sparus macrocephalus）是广泛分布于我国沿海的岛礁性近底层鱼类，也是我国重要的增殖放流对象［4－7］。当前，国内黑鲷增殖放流工作以规模化放流小规格人工繁育苗种形式为主，受苗种规格、标志物经济成本和标记过程时间成本等因素的限制，挂牌标记、金属线码标记和荧光色素可见式标记等传统物理标记手段难以对其实施规模化标记操作，研建适用于小规格黑鲷增殖放流苗种的规模化标记方式已成为有效推进黑鲷增殖放流功效评估工作的当务之急。

耳石元素指纹分析技术的发展为上述标记需求提供了一种解决思路。耳石是沉积在真骨鱼类内耳中的一种矿物结构，主要由碳酸钙、蛋白质及一些微量元素组成。耳石中微量元素的含量与周围水环境特征休戚相关，水环境中的相关元素经过代谢可稳定沉积在特定耳石区位，形成记录鱼体生活履历的耳石元素指纹信息［8］。锶（Sr）是鱼类耳石元素指纹研究中的热点元素，不仅被广泛应用于鱼类群体识别、生活环境重建等研究领域［9－11］，也被用作开展增殖放流鱼苗耳石元素的指纹标记。在增殖放流鱼苗的人工培育阶段，通过阶段性提升增殖放流鱼苗饲养水体中锶元素浓度，使其在处理鱼苗特定耳石区位富集，即可实现对处理鱼苗耳石的元素指纹标记。因该标记方法具备适用于小规格增殖放流鱼苗的规模化标记操作、标记信息终生携带等技术特点，现已成为标记放流领域的探索热点［12－14］。

本研究以黑鲷增殖放流鱼苗为标记处理对象，通过开展基于锶元素的耳石元素指纹标记实验，探究不同浓度富锶水体对黑鲷增殖放流鱼苗耳石的元素指纹标记效果，研究标记处理过程对黑鲷存活率和生长状况的影响，同时分析标记结束后锶元素在标记鱼苗肌体中的衰减规律，以期为利用该项技术开展黑鲷增殖放流鱼苗规模化标记的可行性提供现实依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计

基于锶元素的黑鲷耳石元素指纹标记实验于宁波市海洋与渔业科技创新基地进行。实验对象为该基地人工繁殖培育、用以增殖放流的30日龄黑鲷鱼苗，从中选择体质健壮、规格整齐、体色正常的黑鲷作为实验用鱼［平均体长：（8.64±0.50）mm］。黑鲷鱼苗养殖水体的锶元素浓度为本标记实验的处理因素，标记实验共计设置4个标记处理组和1个对照组，每个处理组和对照组均设有3个平行样，每个平行样选用200尾实验用黑鲷鱼苗，分别置入容积为120 L的养殖容器进行实验处理。对照组所用养殖水体为正常养殖用海水，其锶元素浓度为6.07 mg·L－1；4个标记处理组所用富锶养殖水体的锶元素浓度分别为 18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1，分别通过向正常养殖用海水中人为添加SrCl2·6H2O加以配备完成。标记处理前，实验鱼苗在正常养殖水体进行2 d适应性暂养；随后，按上述实验设计调控养殖水体锶元素浓度，开展标记处理，标记处理共计历时7 d。标记处理结束后，将各处理组养殖水体的锶元素浓度恢复至正常养殖海水水平，继续饲养17 d，随即结束实验。实验期间，实验鱼苗的饵料投喂和养殖设施管理均依实验基地黑鲷鱼苗培育规范操作。

实验期间，在完成标记处理和实验结束两个时间节点分别统计各处理组和对照组黑鲷鱼苗的平均体长和死亡率，用以分析标记处理过程对黑鲷鱼苗生长状况和存活率的影响。另，于标记处理结束、结束后3 d、10 d和17 d共计4个时间点分别从各平行样随机选取5尾黑鲷鱼苗，置入玻璃器皿冷冻保存，用以后续检测分析。此外，在实验对象的增殖目标水域-象山港采集黑鲷当龄野生幼体30尾，用以验证标记处理个体与增殖水域野生黑鲷幼体是否存在耳石元素组成差异。

1.2 样品处理

所取黑鲷样本经体长和称重测量后，取出矢耳石，用于耳石元素测定；黑鲷肌体经微波消解仪消解后，利用Thermo X Series II ICP-MS进行肌体锶元素含量分析。

耳石样本经研磨、抛光处理，制成可观测到耳石核心的厚度约为0.5 mm的耳石薄片，采用激光烧蚀联动的电感耦合等离子质谱仪（LAICP-MS）对耳石样本进行元素分析。利用NewWave 213激光剥蚀系统沿长轴半径从耳石核心至边缘进行激光线扫描剥蚀后（图1），通过Thermo X Series II ICP-MS进行锶、钙测定。在无任何样品条件下对 Ar、He混合气体进行 LAICPMS测试，重复10次，3倍空白标准偏差所对应的浓度即为各元素的检出限，以确定 LAICPMS的元素检测限水平。检测标样为USGS MACS-3碳酸盐标样。激光剥蚀的波长为213 nm，剥蚀孔径为32μm，剥蚀深度为20μm，激光移动速度为20μm·s－1。

图1 黑鲷耳石及元素检测分析路径Fig.1 Map showing the sagitta of juvenile Sparus macrocephalus and line transect for element analysis注：C为耳石核心；L为耳石长轴；W为耳石短轴；R为半径Note：C：sagitta core；L：long axis of sagitta；W：minor axis of sagitta；R：radius

1.3 数据分析

Sr／Ca摩尔比值是基于锶元素耳石元素指纹分析的基础数据。依据上述检测分析结果，首先计算获取各检测样本从耳石核心至耳石边缘的Sr／Ca值；然后，通过对比分析各处理组和对照组鱼苗在耳石标记目标区位的Sr／Ca值差异，阐释标记处理效果。耳石元素指纹标记成功的判别标准参考同位素的判别方式，如下［15］：在耳石标记目标区，存在超过3倍激光剥蚀孔径长度的耳石区位，其任意点位Sr／Ca值均超过标记检测基线。标记检测基线设定为对照组个体在相应耳石区位Sr／Ca值均值与其3.3倍标准差之和。

本研究利用t检验和单因子方差分析（ANOVA）检验标记处理后各处理组和对照组鱼苗存活率和肌体锶元素含量差异，用以分析标记过程对处理鱼苗存活率和肌体锶含量的影响。

2 结果与分析

2.1 标记组和处理组个体的Sr／Ca值

对野生黑鲷幼体和标记实验对照组黑鲷鱼苗耳石的Sr／Ca值检测分析结果显示：上述耳石样本从耳石核心至边缘（沿矢耳石长轴半径，下同）的Sr／Ca值均变异幅度较小，基本保持稳定（图2）。野生黑鲷幼体和标记实验对照组黑鲷鱼苗耳石在检测路径上的Sr／Ca值分别为1.91±0.21和2.02±0.35，t检验显示：两者不存在显著性差异（P＞0.05）。

对标记处理结束后17 d所取的处理组黑鲷鱼苗进行耳石元素检测结果显示：与对照组相比，各处理组样本在距耳石核心约330μm处，Sr／Ca值开始明显升高，并在距耳石核心约400～480μm处形成一个相对平稳的峰，随后Sr／Ca比值开始下降，并逐渐恢复至对照组水平，该Sr／Ca值增高区段即为富锶水体标记处理所形成的耳石元素指纹标记区段。18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1标记处理组黑鲷鱼苗在标记区段峰值区的Sr／Ca均值分别为：（5.57±0.22）mmol·mol－1、（7.21±0.19）mmol·mol－1、（10.40±0.39）mmol·mol－1和（10.59±0.37）mmol·mol－1，其均值分别为标记实验对照组的2.76倍、3.57倍、5.15倍和5.24倍。

本研究以Warren-Myers等设定的耳石元素指纹成功标记判别标准对各处理组的标记成功率进行检测。依实验对照组耳石样本的Sr／Ca均值及其标准差数据求得锶元素指纹成功标记检测基线值为 3.235 mmol·mol－1；依耳石元素检测分析时激光剥蚀孔径求得有效标记宽度下限为96μm。对不同标记处理组各15尾黑鲷样本检测分析发现，各检测样本的有效标记宽度均大于96μm，其均值分别为（180.5±13.3）μm（18 mg·L－1标记处理组）、（199.7±28.9）μm（24 mg·L－1标记处理组）、（191.7±16）μm（30 mg·L－1标记处理组）和（256±62.2）μm（36 mg·L－1标记处理组）。基于上述，各标记处理过程对黑鲷鱼苗耳石元素指纹的标记成功率均为100%。

图2 标记组、对照组和野生黑鲷幼鱼耳石的Sr／Ca值Fig.2 Typical changes in otolith Sr／Ca ratio along line transects from the core to the edge in the wild，control and marked juvenile Sparus macroce phalus otoliths

2.2 标记组和处理组个体死亡率和生长状况

经7 d标记处理，实验对照组、18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1标记处理组黑鲷鱼苗的平均死亡率分别为21.9%、23.9%、23.3%、22.3%和 26.5%（表 1）。单因子方差分析（ANOVA）结果显示，各处理组与实验对照组黑鲷鱼苗的死亡率无显著性差异（F＝0.745，P＝0.582）；标记结束 17 d后，实验对照组、18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1标记处理组黑鲷鱼苗的平均死亡率分别为34.5%、30.3%、28.6%、34.8%和35.4%。单因子方差分析结果显示，此时段各处理组与实验对照组黑鲷鱼苗的死亡率依然无显著性差异（F＝1.345，P＝0.320）。上述结果表明：标记处理过程对黑鲷苗种存活率无显著负影响。

标记处理后，实验对照组、18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1标记处理组黑鲷鱼苗的平均体长分别为16.3 mm、17.1 mm、18.2 mm、16.5 mm和17.9 mm。单因子方差分析结果显示，各处理组与实验对照组黑鲷鱼苗的平均体长无显著性差异（F ＝2.080，P＝0.090）；标记结束17 d后，实验对照组、18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1标记处理组黑鲷鱼苗的平均体长分别为28.0 mm、26.7 mm、25.7 mm、27.3 mm和26.3 mm，单因子方差分析结果显示，此时段各处理组与实验对照组黑鲷鱼苗的平均体长依然无显著性差异（F＝1.698，P＝0.155）。上述结果表明：标记处理过程对黑鲷鱼苗生长状况不产生显著负影响。

表1 标记处理后对照组与处理组黑鲷的死亡率和体长均值及标准差Tab.1 Mean value and standard deviation of mortality rate and body length of control and marked juvenile Sparus macrocephalus after marking treatment

2.3 标记组和处理组个体肌体内的锶元素含量

标记处理结束当天，对照组、18mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1标记处理组黑鲷肌体内的锶浓度均值分别为52 mg·kg－1、138 mg·kg－1、264 mg·kg－1、277 mg·kg－1和346 mg·kg－1（表 2），t检验显示：各标记处理组黑鲷肌体内锶浓度均与对照组存在显著性差异（P值均小于0.05）；表明标记处理过程可使标记处理个体肌体内锶浓度显著提升。

随时间推移，各标记处理组黑鲷肌体内锶浓度逐渐下降。至标记处理结束17 d，18 mg·L－1、24 mg·L－1、30 mg·L－1和 36 mg·L－1标记处理组黑鲷肌体内的锶浓度均值分别降至45.5 mg·kg－1、76 mg·kg－1、91.6 mg·kg－1和106 mg·kg－1（表 2）。t检验显示：该时段 18 mg·L－1标记处理组黑鲷肌体内锶浓度已与对照组个体不存显著性差异（P＞0.05）；表明该处理组黑鲷肌体内锶浓度已恢复至正常水准。

表2 标记处理后不同时段黑鲷肌体中的锶浓度均值和标准差Tab.2 Mean value and standard deviation of strontium concentrations of body tissues for the control and marked juvenile Sparus macrocephalus

3 讨论

小规格增殖放流鱼苗的规模化标记问题长期是水生生物增殖放流关键技术研究领域的一大难点。针对此类增殖放流鱼苗，理想化的标记技术应具备苗种规格限制小、便于规模化操作、较少的标记操作损伤和较长的标记携带周期等技术特点［16－17］。目前，基于锶元素的耳石元素指纹标记是研建此类标记技术的重要探索方向，该标记技术所采用的“浸泡”式标记方式以及标记元素在耳石中的代谢惰性使其本身具备有标记苗种规格限制小、便于规模化操作和标记信息携带长久等技术优势［18］。本研究通过开展基于锶元素的黑鲷耳石元素指纹标记实验，进一步实证了不同浓度富锶水体对黑鲷增殖放流鱼苗耳石的元素指纹标记效果，明确了标记处理过程对受试鱼苗死亡率和生长状况的影响方式，验证了利用该项技术开展小规格黑鲷增殖放流鱼苗规模化标记的可行性。

3.1 富锶水体对黑鲷幼鱼耳石的标记效果

本研究利用富锶水体对黑鲷增殖放流鱼苗进行耳石元素指标标记实验，预期标记效果为在受试黑鲷鱼苗相应耳石区位形成易被鉴别的Sr／Ca值标记。以前期同类研究为参考［15］，本文将受试鱼苗成功标记的判别标准设定为存在超过3倍激光剥蚀孔径长度的耳石区位，其任意点位Sr／Ca值均超过标记检测基线（即对照组个体在相应耳石区位Sr／Ca值均值与其3.3倍标准差之和）。本研究结果显示，经7 d的标记处理，各处理组黑鲷鱼苗耳石均能形成了与对照组或野生个体的Sr／Ca值差异；依上述成功标记判别标准，本研究所用的标记处理方式对黑鲷鱼苗耳石的标记成功率均为100%。

从本研究所采用的标记处理过程看，标记水体锶元素浓度和标记处理时间是影响受试鱼苗耳石标记效果的核心要素。理论上讲，标记水体锶浓度越高，所形成的标记强度（标记区段处理组个体与对照组个体的Sr／Ca值差异大小）越大；标记处理时间越长，所能标记的耳石范围越广［18］。本研究发现，无论从标记强度还是标记范围上看，各处理组均明显高于成功标记所需标记强度和标记范围的最低阈值。从降低标记处理的经济、时间成本的角度考量，标记水体的锶元素浓度和标记处理时间均有进一步压缩的空间；至于具体压缩的程度，有待进一步实验确认。

3.2 标记处理过程对受试黑鲷死亡率和生长状况的影响

标记操作对鱼体的损伤大小是选择适宜标记方法的重要考量因素。挂牌标志、金属线码标记等传统物理标记方法因会给标记对象带来个体创伤和额外的代谢负担，严重制约了其适用范围［19－20］。本研究结果显示，各标记处理组与对照组黑鲷鱼苗的死亡率和生长状况均无显著性差异，这表明利用锶浓度在18～36 mg·L－1范围内的富锶水体对黑鲷鱼苗进行标记处理不会对受试鱼苗的存活和生长产生显著负面影响，标记过程不会产生操作损伤。

锶元素广泛存在于自然界中，锶离子与钙离子在鱼体内具有相同的运输离子通道、相似的化学性能，但其在水生生物内的生理作用至今尚未明确［21］。文献检索发现，不同水生生物物种、不同个体发育阶段对富锶水体的响应方式各异。PILLARD等［22］研究发现：伴随饲养水体中锶浓度提升，巴西拟糠虾（Mysidopsis bahia）和杂色鳉（Cyprinodon variegatus）的存活率并未出现异常，但美洲原银汉鱼（Menidia beryllina）的死亡率却大幅提升。PYLE等［23］研究发现水体中的锶元素浓度与黑头呆鱼（Pimephales promelas）鱼类孵化率具有显著相关性，但与其幼苗生长和存活率关系不紧密。宋洪建等［21］研究发现，当饲养水体中锶浓度提升至30～40 mg·L－1时，大马哈鱼（Oncorhynchus keta）稚鱼肌肉中Ca2＋－ATP酶和Na＋／K＋－ATP酶的活性受到抑制，生长和死亡率受到影响。基于上述，建议在尚未系统掌握锶元素的生理作用及生态毒理效应之前，利用富锶水体开展增殖鱼苗耳石元素指纹标记时应尽量控制锶元素浓度的提升幅度。

3.3 标记处理过程对受试黑鲷肌体中锶含量的影响

黑鲷标记放流鱼苗进入增殖水域后有部分个体会被人类回捕用以食用消费。鉴于此，不产生额外的食品安全问题应作为选择黑鲷增殖放流苗种标记方法的一项基本准则。现阶段，锶元素对人体的影响方式仍不甚明确［24－25］，尚无相关食品安全标准对水产品锶元素含量携带阈值进行界定，为避免产生因标记行为带来相关食品安全问题，标记放流个体的锶含量应与对照个体尽量保持一致。

本研究发现，经7 d的富锶水体处理，受试黑鲷肌体内的锶含量显著提升，且提升幅度与标记水体中的锶浓度显著相关，标记水体中锶浓度越高，受试黑鲷肌体对锶元素的富集程度越大。但与此同时，值得关注的是，与耳石中锶元素一旦富集难以被异化吸收的情景不同，伴随标记处理结束，各标记处理组黑鲷肌体中的锶含量均呈现不断衰减的趋势。至标记结束17 d，18 mg·L－1标记处理组黑鲷肌体中的锶元素已降至实验对照组水平；其它处理组黑鲷肌体中的锶元素亦较标记处理结束时大幅降低，受实验周期限制，24～36 mg·L－1处理组恢复至正常水平的具体时间无法通过本研究获取，需经后续研究进一步验证。鉴于上述，在利用富锶水体进行黑鲷增殖放流鱼苗耳石元素指纹标记操作后，建议进行一定时期内的暂养，待其肌体中的锶元素含量恢复至正常水准后再进行放流，以确保消除标记过程可能产生的食品安全隐患。

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