王蔚 吕青山 郁勤龙 陈恒威 沈伟锋

结核病是由结核分枝杆菌引起的严重危害人类健康的慢性传染病，以肺结核多见。2017年WHO报告最新数据表明，我国2016年肺结核发病患者近87万例，位居全球第三位，防治疫情仍较严峻[1]。目前，疑似肺结核患者筛查方法仍以痰涂片镜检和结核分枝杆菌培养为主，前者敏感度低，后者耗时长，均不能满足临床早期、快速诊断的需求。2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示，我国目前活动性肺结核患者约有75%为涂阴肺结核[2]，采用传统涂片镜检方法无法及时发现该类患者，极易延误病情，对结核病疫情控制极为不利，如何早期发现肺结核成为亟需解决的难题。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(GeneXpert MTB/RIF，简称“Xpert检测”)为基于荧光定量聚合酶链式反应技术(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)，直接检测标本中有无结核分枝杆菌感染及利福平耐药基因，逐渐引起国内外关注。已有多家结核病参比实验室、临床研究中心采用涂阳或培阳标本对该检测系统进行评估，认为该技术具有较高的敏感度和准确性[3-4]，但是对于初诊疑似患者，尤其是涂阴肺结核患者的检测效能的系统评估仍较少。笔者基于此背景，收集初诊疑似肺结核患者痰标本，以临床诊断和传统药物敏感性试验(简称“药敏试验”)比例法为标准，分析Xpert检测结核分枝杆菌和利福平耐药性的效能，综合评价Xpert检测对初诊疑似及涂阴肺结核患者的快速诊断价值。

资料和方法

一、临床资料

收集2015年1月至2016年12月浙江省嘉兴市第一医院就诊的361例初诊疑似肺结核患者痰标本(均按照规范留取)，分别进行涂片荧光金胺O染色镜检(简称“涂片镜检”)、结核分枝杆菌MGIT 320液体培养(简称“液体培养”)和GeneXpert MTB/RIF检测(简称“Xpert检测”)，纳入患者均为初次来我院就诊，伴有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、低热、盗汗等临床症状，或胸部影像学检查的表现与活动性肺结核相似，且近2年内未使用过抗结核药物的患者。361例疑似患者最终临床诊断为：肺结核184例(50.97%)，包括男103例(55.98%)、女81例(44.02%)，年龄11～79岁、平均(44.67±12.03)岁；肺部感染162例(44.88%)；非典型分枝杆菌肺部感染15例(4.15%)。

二、诊断标准

1.涂阴肺结核[5]：必须具备以下标准：①至少3份痰标本抗酸杆菌涂片镜检阴性；②符合活动性肺结核病变的胸部X线摄影表现；③临床上可排除其他非结核性肺部疾病。同时满足以下辅助指标中的任何一项即可确诊：①结核菌素皮肤试验(PPD 5TU)强阳性；②血清结核抗体阳性；③痰结核分枝杆菌PCR荧光探针检测阳性；④肺外组织病理学检查证实结核病变。

2.肺部感染[6]：患者出现咳嗽、咳痰等症状，肺部可闻及湿性啰音，可出现发热或白细胞计数增高或影像学检查提示有炎性反应等。

3.非典型分枝杆菌肺部感染[7]：具有呼吸系统症状和(或)全身症状，胸部影像学显示炎性病灶及单发或多发薄壁空洞，病变多累及上叶尖段和前段，CT可有结节影、斑片及小斑片样实变影、空洞影、支气管扩张、树芽征、磨玻璃影、线状及条索影等多种形态病变混杂存在，实验室查痰菌2次培养到同一种非结核分枝杆菌。

三、仪器与试剂

金胺O染色液(杭州创新生物检控技术有限公司)，CX40FL型荧光显微镜[宁波舜宇光学科技(集团)有限公司]；结核分枝杆菌BACTECT MGIT 320液体培养仪及配套试剂(美国BD公司)；GeneXpert MTB/RIF检测系统和配套试剂(美国 Cepheid公司)；结核分枝杆菌抗原检测试剂盒胶体金法(杭州创新生物检控技术有限公司)。

四、检查方法

按照《结核病实验室检验规程》[8](简称“《规程》”)分别进行以下检查。

1.痰涂片镜检：留取痰液3～5 ml进行涂片、荧光染色及LED显微镜镜检(物镜“×40”，目镜“×10”)，暗视野下呈黄色荧光，杆状略弯曲菌体为阳性结果；判读标准为：0条/50个视野为阴性；1～9条/50个视野报告实际条数；10～49条/50个视野为“1+”；1～9条/每个视野为“++”；10～99条/每个视野为“+++”；100条及以上/每个视野为“++++”；报告“++”至少观察50个视野，“+++”及以上的阳性结果至少观察20个视野。

2.痰结核分枝杆菌液体培养：取痰液1～1.5 ml用N-乙酰半胱氨酸(NALC)-NaOH处理后，接种于BACTECT MGIT 320液体培养基进行液体快速培养，仪器自动报阳后对阳性管涂片抗酸染色镜检确认，同时采用结核分枝杆菌抗原检测试剂盒鉴定菌种。

3.Xpert检测：取备用痰液1 ml置于无菌螺纹管中，加入样本试剂(sample reagent)处理液2 ml，旋紧螺纹管，漩涡震荡15～30 s，室温静置15 min，使痰标本充分液化。取2 ml 处理后样品加入反应盒，将反应盒置于检测模块，仪器开始自动检测。以ropB基因为靶序列，同时采用6种分子信标探针检测，上述探针循环阈值(Ct值)≤38即为阳性，即5个探针中至少2个探针Ct值≤38即为检测到结核分枝杆菌；对利福平的药敏试验：再根据特异性分子信标早期Ct值和晚期Ct值之差，即△Ct值确定是否对利福平耐药，当△Ct值>3.5时提示对利福平耐药，△Ct值≤3.5时提示对利福平敏感。由于终止循环数为38个循环，当早期探针Ct值>34.5或晚期探针Ct值>38时，结果为不确定[9]。

4.结核分枝杆菌固体药敏试验比例法：将培养阳性菌株采用比例法对4种一线抗结核药物(利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇)进行耐药性测试，判断药敏试验结果。

5.菌种鉴定：采用免疫法，将培养阳性菌液滴入结核分枝杆菌抗原检测试剂盒，判断是否为结核分枝杆菌。

6.病理学和影像学检查：参照文献[5]和[10]中的步骤及标准进行检查及判读。

五、相关公式

敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；正确指数=敏感度+特异度-1

六、统计学处理

使用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，以临床诊断为金标准，采用卡方检验对涂片镜检法、培养法和Xpert检测的结果进行比较分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、361例初诊疑似肺结核患者的检测情况

在361例初诊疑似肺结核患者中，涂片镜检、液体培养和Xpert检测的阳性率分别为22.71%、26.32%、32.41%；涂片镜检与Xpert检测比较差异有统计学意义(χ2=8.49，P<0.05)；液体培养与Xpert检测比较差异无统计学意义(χ2=3.23，P=0.072)，涂片镜检法与液体培养法比较差异也无统计学意义(χ2=1.26，P=0.261)。184例肺结核患者中，涂片镜检(36.41%)和液体培养的阳性率(48.91%)分别和Xpert 检测结果(63.59%)比较，差异均有统计学意义(χ2=27.17，P<0.01；χ2=8.05；P<0.05)(表1)。

二、不同检测方法对初诊疑似肺结核患者的检测效能：以临床确诊患者为金标准，计算3种方法的检测效能，见表2。

三、Xpert检测对涂阴肺结核患者的检出情况

在184例肺结核患者中，涂片镜检阴性的117例标本中液体培养阳性29例，则涂阴肺结核患者的培养阳性率为24.79%；涂阴的117例标本中Xpert检测阳性50例，Xpert检测对涂阴肺结核患者的阳性检出率为42.74%，具体见表3。液体培养和Xpert检测对117例涂阴肺结核患者的阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=8.43，P=0.004)。

表1 三种检测方法对361例疑似肺结核患者的检测结果

注括号外数值为“患者例数”，括号内数值为“比率(%)”

表2 三种方法以临床确诊患者为金标准的检测效能

表3 涂阴肺结核液体培养和Xpert检测的阳性检出情况

注括号外数值为“患者例数”，括号内数值为“构成比(%)”

四、固体药敏试验比例法与Xpert检测对培阳患者利福平药敏试验结果分析

按操作规程，以固体药敏试验比例法为标准，对90株培养阳性菌株进行固体药敏试验和Xpert检测利福平ropB耐药基因。结果显示，固体药敏试验比例法有5株对利福平耐药，其中4株Xpert检测利福平耐药、1株敏感，该敏感株经基因芯片检测，检测到ropB基因531(TCG-TTG)突变位点；另85株固体药敏试验比例法敏感菌株中有2株Xpert检测利福平耐药、83株敏感，对结果不相同的2株Xpert 检测耐药株进行基因芯片检测，1株未检测到ropB基因突变位点，1株为ropB基因531(TCG-TTG)突变。以固体药敏试验比例法结果为金标准，Xpert 检测利福平耐药的敏感度为4/5，特异度为97.70%(85/87)，正确指数为0.97(87/90)。因实验室条件限制，进行基因芯片检测的结果数据未进行测序。

讨 论

肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的传染病，细菌学检查是诊断的确切依据。我国目前主要依赖于痰涂片镜检进行肺结核的诊断与随访时疗效的监测[11]。痰涂片镜检阴性的疑似肺结核患者诊断需根据结核分枝杆菌培养结果及患者临床症状、影像学表现、病理学检查等结果，耗时较长，对疾病控制极为不利。Xpert检测系统基于荧光定量PCR技术，整合样本制备、核酸纯化浓缩和荧光定量PCR扩增的检测过程，在一个封闭的试剂盒中自动完成，2 h内可得到检测结果。早在2010年，WHO就发表声明认可并推荐Xpert检测在结核病防治规范中的应用，认为它对肺结核的诊治具有里程碑式的意义[12]。

国内外已有较多文献报道Xpert检测系统在涂阳或培阳患者中的检测效能。有资料显示，Xpert检测在肺结核涂阴培阳患者中的敏感度可达57%～76.9%，涂阳培阳患者中达98%～100%[13]。菌阴肺结核患者尤其是涂阴肺结核患者临床表现不典型，胸部影像的空洞情况明显少于涂阳患者[14]，症状较轻，个人不重视检查，不能被及时发现；同时又缺乏细菌学诊断依据，临床上诊断难度较大，极易造成漏诊误诊。有研究报道，涂阴肺结核患者传染性仅次于痰菌阳性的肺结核患者，与该群体密切接触者被感染的概率达7.3%～21%[15]。因此，及时发现初诊涂阴肺结核患者，对于控制结核病传播，提高患者规范治疗机会有着重要意义。

本研究通过对初诊为疑似肺结核的患者进行痰涂片、结核分枝杆液体菌培养及Xpert检测，发现在临床诊断肺结核患者中，Xpert检测方法的敏感度(63.59%)和特异度(100.00%)明显高于涂片镜检(分别为36.41%和91.52%)和液体培养(分别为48.91%和91.52%)，但比文献报道95%的敏感度略低[16]，分析原因可能与本研究患者选择以临床诊断为金标准有关，将临床诊断为肺结核的初诊患者纳入研究，存在一定比率的菌阴或涂阴肺结核患者，而文献中是以培阳或涂阳的患者为研究对象；Xpert检测结果阳性预测值(100.00%)和阴性预测值(72.54%)均高于涂片镜检(分别为81.71%和58.06%)和液体培养(分别为85.71%和63.28%)，表明Xpert在初诊疑似肺结核患者实验室检测中的效能远高于涂片镜检和液体培养。

同时本研究显示，对于117例初诊涂阴肺结核患者，Xpert检测的阳性率为42.74%(50/117)，即有近1/2的初诊肺结核患者无法通过涂片镜检进行筛查，需根据结核分枝杆菌培养、临床症状、影像学表现、血清学抗体检测及组织病理学等方法相结合进行诊断。现通过Xpert技术可以直接检测痰标本，降低了对患者的有创诊疗操作，可快速检测到患者体内的少量结核分枝杆菌，及时进行干预。有文献报道，与涂片镜检法相比，Xpert技术能使结核分枝杆菌检出率提高11.7%～50.0%[17]。另有研究表明，对于菌阴肺结核采用支气管灌洗液进行Xpert 检测优于痰液标本，阳性率可达70%以上；但是对于存在采用纤维支气管镜支气管灌洗液检查禁忌证和其他特殊患者，仍建议采用痰液检查，无创伤，标本易采集[18]。美国食品药品监督管理局(FDA)曾在2015年发文表示，肺结核患者治疗后可采用Xpert检测痰标本，结果阴性作为早期解除呼吸道隔离的标准，对于可疑肺结核患者，可依Xpert检测痰结果判断是否需要进行呼吸道隔离[19]。我国2018年即将实施的最新肺结核诊断行业标准规定分子生物学检测结核分枝杆菌阳性，同时满足影像学表现的患者，即可确诊肺结核[20]。因此，对于疑似肺结核患者，Xpert检测结果可直接明确诊断，达到早期诊断、及时治疗的目的；尤其对于初诊涂阴患者，意义更加重大。

另一方面，在对培阳肺结核患者耐药检测中，以固体药敏试验比例法为金标准，Xpert检测利福平耐药的敏感度为4/5，特异度为97.70%(85/87)，与比例法检测利福平药敏试验结果的正确指数达0.97，与文献报道相似[9]。传统固体药敏试验比例法耗时需4周，通过Xpert检测的使用，可以快速预测利福平耐药性，早期制定用药方案。

综上所述，作为结核病诊治基层医院，可推荐采用Xpert技术对疑似结核病患者进行检测，及早发现结核感染与耐利福平肺结核，为患者创造治疗与治愈结核病的机会，防止耐药结核病的形成与播散。

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