王 雯 姚作娇 陆 巍 沃春新 姚 旌 张忠杰 王 林△

（1贵州医科大学附属医院疼痛科，贵阳550004；2黔西南州人民医院麻醉科，贵州黔西南562400）

骨性关节炎(osteoarthritis, OA)是老年人最常见关节疾病之一，其病理改变主要是关节软骨退变，软骨下骨赘形成，滑膜慢性炎症，关节周围韧带损伤等，该病伴随关节僵硬，关节肿胀，晚期有一定的致残率[1]，本病发病多与肥胖、关节过度使用、衰老、遗传因素等多因素相关。发病机制也不完全清楚，该病发病率逐年上升，发病年龄年轻化，成为近年来骨科及相关科室就诊率极高的病种，传统治疗多于晚期出现关节腔严重病变，出现关节腔病变后给予治疗，效果往往不尽如人意。故近年来，探索OA发病机制、早期阻断炎性介质的释放信号通路，寻找OA治疗靶点成为国内外研究的方向。下游表达的炎性细胞因子公认参与了OA的发生发展[2]。TWEAK作为肿瘤坏死因子超体家族的新成员之一倍受关注。而Fnl4是近年来研究较多的特异性受体，它广泛存在于TWEAK高敏感性器官和组织。TWEAK/Fnl4发挥生物学效应可以通过激活激活NF-κB、ERIC、JNK及MARK等信号途径发挥。有研究认为TWEAK及其配体Fn14也参与了骨性关节炎的病理过程[3]。但就TWEAK抗体干预和治疗OA的动物模型的研究现国内外尚未见报道。有研究发现[4]，在大鼠OA模型中，TWEAK及其受体Fn14的mRNA和蛋白表达在滑膜及软骨中均有明显增加，但对于阻断TWEAK及其受体Fn14的表达是否影响OA的发生及发展，国内外相关研究较少。本实验拟通过建立OA动物模型，通过建模前对TWEAK通路进行阻断，观察OA与TWEAK/Fn14关系以及其可能激活的下游炎性因子IL-1β、TNF-α改变，探讨TWEAK/Fn14激活是否在OA发生发展中起重要作用。以期进一步阐明OA的发病机制，并为探寻防治OA有效的新靶点提供理论和实验依据。

方 法

1.实验动物及分组

24只健康2～3月龄SD大鼠(雌雄各半)（贵州医科大学动物试验中心提供），体重200～250 g（实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》），随机分为3组，即正常组、模型组及TWEAK抗体组，每组8只。

2.主要试剂和仪器

逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒（北京天根生化科技有限公司）、引物（英滩基捷（上海）贸易有限公司）、兔抗鼠TWEAK单克隆抗体（美国Abcam公司）、核酸蛋白分析仪 Beckman Coulter DU640型 、PCR 扩增仪 PE 2400型、实时荧光定量PCR仪 PE 5700型、ⅡaB型臭氧发生仪（德国Herrmann Apparatebau GmbH）。

3.动物模型制作

正常组不做任何处理，其余两组分别在1、4、7天于左膝关节腔注射4%木瓜蛋白酶进行骨性关节炎动物模型复制[5]。TWEAK抗体组大鼠在造模前1小时将大鼠固定后，用10%水合氯醛对大鼠腹腔注射(0.06 ml/10 g)进行麻醉，经鼠尾静脉注射TWEAK单克隆抗体(225 μg/kg)[6]。在实验完成后一周，麻醉后用颈椎脱臼法处死大鼠，取膝关节滑膜组织，部分标本立即置于10%中性甲醛液固定24 h分组标记,石蜡包埋。部分组织保存于-80℃冰箱中，作为real-time PCR组织标本。

4.关节滑膜实时荧光定量PCR检测TWEAK和Fnl4的表达

（1）RNA提取：将滑膜组织加入研钵中，加用少量液氮，简单研磨。加入Trizol液1 ml，研磨成液体。加入200 μl氯仿，适度摇匀15秒，室温下放置2～3 min。高速冰冻离心 4 ℃ 12 000转，15 min。取上清约 400 μl,加入异丙醇 400 μl,上下颠倒混匀，室温下静置10 min，高速冰冻离心 4 ℃12 000转，10 min，弃上清。70%乙醇1 ml（DEPC水配制）洗涤1次，高速冰冻离心 4 ℃ 7 500转，5 min。弃上清，干燥10 min。加入30 μlDEPC水充分溶解备用。

（2）逆转录成cDNA：根据逆转录FastQuant RT Kit试剂盒说明书操作，反应体系（20 μl）；5×gDNA Buffer 2 μl；10×Fast RT Buffer 2 μl；RT Enzyme Mix1μl；FQ-RT Primer Mix 2 μl；RNase-Free ddH2O根据实际情况补足至20 μl。将上述混匀，放入PCR扩增仪中42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min之后放置冰上，得到的cDNA用于后续试验，保存于-20 ℃冰箱。

（3）荧光实时测定PCR：根据 RT-PCR试剂盒进行操作：根据TWEAK及FN14基因序列设计并合成PCR引物：

TWEAK引物 (F)5'-AGGTGTCTGGGCTGTTGC-3' (R)5' -TAGAGGGTGGAGGAGTGGG-3' Fn14引物 (F)5' -AGCAAGCACCAGGCAACG-3' (R)5' -CGCATCCCAGGCAGAAGT-3' GAPDH引物(F)5'-TATCGGACGCCTGGTTAC-3 (R)5'-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3'

完全融化cDNA，特异性引物，2×Super-Real PreMix Plus，50×ROX Reference Dye△ ,RNase-free ddH2O,短暂离心后置于冰上。2×Super-Real PreMix Plus 10 μl；50×ROX Reference Dye △2 μl；上、下游特异性引物各 0.6 μl；cDNA 模板 3 μl；RNase-Free ddH2O根据实际情况补足至20 μl。扩增反应条件：95 ℃，5 min；95 ℃预变性15 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 30 s，共进行40个循环；数据采用仪器自带软件分析(ABI Prism 7500 SDS Software)，用△△Ct法进行各基因表达的相对定量。

5.免疫组化法检测IL-1β,TNF-α在滑膜中的表达

切片用DAB染色的阳性结果为软骨细胞胞浆/胞核呈棕褐色或棕黄色颗粒,淡黄色为弱阳性，黄色为阳性，棕黄色为中度阳性，棕褐色为强阳性。镜下（× 200）随机观察不重叠的五个视野，计数各因子胞浆阳性细胞数，取平均值。

6.统计分析

所有的实验数据均为定量资料，采用excel建立数据库。使用SPSS V 13.0统计软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差(±SD)表示，组间比较先确定样本是否符合正态分布，若比较结果有统计学意义，继续采用t检验进行组间比较，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.滑膜组织HE染色光镜观察

①正常组：滑膜上皮细胞为单层、扁平样分布，滑膜组织结构正常（见图1）。②模型组：滑膜上皮细胞表现为明显增生，细胞层次明显增多，排列不均，可见部分滑膜组织结构破坏，出现组织水肿、变性及坏死，部分区域伴有血管扩张充血，部分区域甚至出现炎性肉芽组织及纤维组织增生（见图1）。③TWEAK抗体组：滑膜上皮出现局部增生，细胞层次增多。未见明显纤维增生及血管增生（见图1）。

2.实时荧光定量PCR检测滑膜中TWEAK mRNA表达

TWEAK mRNA表达：模型组、TWEAK抗体组与正常组比较均有明显增高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；TWEAK抗体组和模型组比较表达降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05，见表1）。

3.实时荧光定量PCR检测滑膜中Fnl4 mRNA表达

Fn14 mRNA的表达：模型组、TWEAK抗体组与正常组比较均有明显增高，有统计学差异（P＜ 0.05）；TWEAK抗体组和模型组比较表达降低，有统计学差异（P＜ 0.05，见表1）。

4.免疫组化检测IL-1β的表达

与正常组相比，模型组细胞阳性率显著增加，差异有统计学意义（P＜ 0.05，见表2）；与模型组相比，TWEAK抗体组细胞阳性率显著降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05，见表2、图2）。

5.免疫组化检测TNF-α的表达

与正常组相比，模型组细胞阳性率显著增加，差异有统计学意义（P＜ 0.05，见表2）；与模型组相比，TWEAK组细胞阳性率显著降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05，见表2、图3）。

讨 论

OA是一种常见的关节慢性病变，是力学和生物学共同作用下造成的老年性疾病[7]。有研究认为滑膜炎性病变在骨关节炎的发生中并不是旁观者，而是关节破坏的直接参与者，促进了骨关节炎的病程进展[8]。

本研究结果显示，模型组滑膜上皮细胞明显增生，细胞层次明显增多，排列不均，可见部分滑膜组织结构破坏、组织水肿、变性及坏死，部分区域伴有血管扩张充血，甚至出现炎性肉芽组织及纤维组织增生。同时滑膜组织IL-1β及TNF-α的表达增高，进一步证实了炎性细胞因子参与了OA的发生发展[9]。滑膜是被覆关节腔内面的纤维结缔组织，可以分为靠近关节腔的滑膜内层(滑膜衬里层或滑膜细胞层)及其滑膜下层 (滑膜衬里下层)。滑膜出现炎症后，滑膜细胞[10～12]不仅会丧失许多生理功能，而且还分泌过多的IL-1,TNF-α、IL-6等炎性细胞因子诱导蛋白溶解酶合成，这些炎性成分又可作用于软骨细胞、滑膜细胞及其周围组织进一步促进致炎因子的产生，加速软骨基质降解，终至出现软骨破坏。此外，因炎症而变形的滑膜皱璧可伸入关节间隙，与关节软骨面相互挤压摩擦，加重对软骨的物理损伤。因此有学者认为滑膜炎症可能为OA病理演变中重要的“启动子”并贯穿整个病理过程[13]。

表1 不同组大鼠滑膜组织中TWEAK / Fnl4 mRNA表达(n = 8,±SD)Table1 The expressions of TWEAK/ Fnl4 mRNA in synovial of rats in different groups (n = 8,±SD)

表1 不同组大鼠滑膜组织中TWEAK / Fnl4 mRNA表达(n = 8,±SD)Table1 The expressions of TWEAK/ Fnl4 mRNA in synovial of rats in different groups (n = 8,±SD)

*P ＜ 0.05，与正常组相比，compared with the normal group； #P ＜ 0.05，与模型组相比，compared with the model group.

TWEAK抗体组TWEAK antibody group TWEAK mRNA 0.21±0.15 0.79±0.21* 0.41±0.17*#Fn14mRNA 0.18±0.17 0.63±0.24* 0.38±0.24*#组别Group正常组Normal group模型组Model group

表2 不同组大鼠滑膜组织中IL-1β、TNF-α表达(n = 8,±SD)Table 2 The expressions of IL-1β and TNF-α in synovial of rats in different groups (n = 8,±SD)

表2 不同组大鼠滑膜组织中IL-1β、TNF-α表达(n = 8,±SD)Table 2 The expressions of IL-1β and TNF-α in synovial of rats in different groups (n = 8,±SD)

*P ＜ 0.05，与正常组相比，compared with the normal group； #P ＜ 0.05，与模型组相比，compared with the model group.

TWEAK抗体组TWEAK antibody group IL-1β 15.24±2.64 52.35±4.23* 32.72±4.57*#TNF-α 12.34±3.21 47.56±3.45* 34.24±3.27*#组别Group正常组Normal group模型组Model group

图1 滑膜 HE (A) 正常组(B)模型组(C) TWEAK抗体组 (Scale bar = 200 μm)Fig.1 HE staining of synovial in normal (A) model (B) and TWEAK antibody group (C) (Scale bar = 200 μm)

图2 滑膜 IL-1β表达(A)正常组(B)模型组(C) TWEAK抗体组(Scale bar = 200 μm)Fig. 2 The expressions of IL-1β in synovial of rats in normal (A) model (B) and TWEAK antibody group (C) (Scale bar = 200 μm)

图3 滑膜 TNF-α表达(A)正常组(B) 模型组(C) TWEAK抗体组( Scale bar = 200 μm)Fig.3 The expressions of TNF-α in synovial of rats in normal (A) model (B) and TWEAK antibody group (C) (Scale bar = 200 μm)

肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂 (tumor necrosis factor. like weak inducer of apoptosis, TWEAK) 作为肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor, TNF) 超体家族的新成员之一倍受关注[14]。而Fnl4是近年来研究较多的、TWEAK的特异性受体，它广泛存在于TWEAK高敏感性器官和组织。TWEAK/Fnl4发挥生物学作用可以通过激活多条信号通路发挥生物学效应，其中包括激活NF-κB、ERIC、JNK及MARK等信号转导途径，可以引起一系列的相关生物学效应[15]，NF-κB信号转导途径被认为有着重要的作用。TWEAK/Fnl4与TRAF分子结合可以激活两条NF-κB相关信号通路：P100程序化和IκBα磷酸化[16]。已有研究证实NF-κB的表达在OA关节液及软骨中明显增高[17]。NF-κB活化后可以进入细胞核，与许多免疫调节因子或促炎因子结合，启动基因转录，生成诱导型酶类 (如诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶、磷脂酶A)、急相蛋白、细胞因子、黏附分子等。而这些由NF-κB所激活的细胞因子包括了 MMP-9, MMP-13, IL-1β, TNF-α等，这些细胞因子在骨性关节炎的发病中起到了重要作用。有学者证实[18]TWEAK/Fn14不仅仅参与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾脏损伤、多发性硬化等免疫风湿性疾病，而且高表达于脑卒中、哮喘及心肌梗塞等疾病。动脉粥样硬化、系统性红斑狼疮将TWEAK作为早期的诊断和疗效的生物标记[19]。研究表明在膝关节骨性关节病人血液中NF-κB的表达也有明显增高，TWEAK作为NF-κB的上游激活剂，有研究认为TWEAK及Fn14也参与了骨性关节炎的病理过程[20]。但就TWEAK抗体干预和治疗OA的动物模型的研究现国内外尚未见报道。

本实验结果显示大鼠OA造模成功后，模型组大鼠OA滑膜的TWEAK及Fn14较正常组均出现明显的增高，同时滑膜组织IL-1β及TNF-α的表达也增高，而TWEAK抗体组大鼠OA滑膜的TWEAK及 Fn14表达则降低 (P＜ 0.05)，IL-1β及 TNF-α 的表达也同时降低 (P＜ 0.05)，滑膜组织病理变化程度较模型组改善，提示TWEAK及Fn14参与了OA的发生发展，鉴于于TWEAK具有趋化因子分泌、细胞增生促进炎性细胞因子等生物学效应，因此推测膝关节滑膜组织中TWEAK及Fn14 mRNA表达的增加可能是OA疾病启动因素之一。然而，TWEAK抗体组大鼠OA滑膜的TWEAK及Fn14表达、IL-1β及TNF-α的表达均未降至正常水平，本次研究中所用的为TWEAK多克隆抗体，且给药途径为经鼠尾静脉给药，给药的剂量也为相关实验研究的给药剂量下限，故推测是否与TWEAK抗体剂量、给与的时机以及抗体给药方式有关有待进一步研究探明。

综上所述，大鼠膝关节OA滑膜组织中TWEAK及Fn14 mRNA表达的增加可能是OA疾病启动因素之一，参与了OA的发生发展，为临床上OA的治疗提供新的思路及治疗靶点。

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