焦奥，李晓航，石悦，吕武，孙宁，张城硕，李峰，张佳林

（中国医科大学附属第一医院肝胆外科暨器官移植科，沈阳 110001）

肝脏组织工程是在体外构建仿生的肝组织，用于肝脏的替代治疗，但肝脏组织体积庞大、代谢异常活跃，没有血管输送氧气和养料就会迅速衰竭［1］，所以肝脏组织工程血管化是亟待解决的问题。本研究通过细胞电融合法构建了一株由肝细胞系与胰岛内皮细胞融合而成的杂交细胞系BRL-ies。流式细胞仪鉴定结果显示，融合细胞体积、细胞内颗粒密度均显著增加，胞内DNA含量加倍。实时定量PCR及Western blotting检测结果显示，BRL-ies既表达肝组织特异性蛋白GS，又表达内皮细胞特异性抗原CD31。BRL-ies细胞的构建方法可为解决肝脏组织工程种子细胞血管化问题提供一个新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SD大鼠，雄性，体质量200～250 g，购自本溪长生生物公司。

1.1.2 细胞系：大鼠肝细胞BRL-3A购于中国科学院细胞库。

1.1.3 设备：细胞融合仪 （宁波新芝电融合仪CRY-3B） 。

1.1.4 试剂：RPMI 1640、DMEM高糖培养基购于南京凯基公司；FBS胎牛血清购于美国Gibco公司；甲磺酸乙酯 （ethyl methanesulfonate，EMS） 、8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，8-AG） 、HAT培养基添加剂、HT培养基添加剂、胶原酶Ⅴ型购于美国Sigma 公司；D-Hanks、CCK-8试剂盒、细胞周期检测试剂盒购于上海碧云天公司。实时PCR相关试剂购于日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：大鼠肝细胞BRL-3A用含10% FBS的DMEM高糖培养基于37℃、5% CO2培养箱内培养。

1.2.2 BRL-3A细胞HGPRT缺陷型的构建及筛选：按照文献［2］的方法，将BRL-3A细胞按2×105/孔铺入6孔板中。12 h后更换含500 μg/mL EMS的完全培养基培养基诱变24 h。之后在显微镜下观察，见半数漂浮死亡，PBS洗3次，更换普通培养基，连续培养72 h。……