杨娜，刘丰林

(开封市中医院，河南　开封　475001)

我国的糖尿病发病率高达9.7%，全国糖尿病人接近一亿，并且有继续增长的势头[1]。中医药在糖尿病的治疗方面历史悠久、疗效显著，其整体调节的作用有着化学药无法比拟的优势[2-3]，在前人治疗糖尿病的基础上，依据辨证论治的原则，通过长期实验筛选，开封市中医院总结开发出十一味益肾降糖方，该方由黄芪、生地黄、白术、山茱萸、益母草、山药等中药组成，具有益气健脾、补肾降糖、利水消肿之功能，方中黄芪、山药补中益气；生地黄、山茱萸止咳生津养阴。诸味药合用，可发挥健脾益气、清热养阴之功能。在此方基础上研制的十一味益肾降糖片，获得河南省食品药品监督管理局院内制剂批文(豫药制字Z04020164)，在治疗糖尿病、肾病方面具有较好疗效[4]。

该方中山茱萸所含马钱苷和莫诺苷是目前研究较多的药效成分，具有广泛的药理活性。为了更加准确全面地控制十一味益肾降糖片的质量，本文建立了一种简单快速的LC-MS/MS法，用于同时测定十一味益肾降糖片中马钱苷和莫诺苷的含量，为其质量评价提供良好的依据。

1　仪器与试药

1.1 仪器

Finnigan TSQ Quantum Discovery液相色谱质谱联用系统(美国Thermo公司)；BS110S Sartorius电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；AS3120A 超声清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；MICRO-17R高速低温离心机(美国Thermo公司)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。

1.2 试药

十一味益肾降糖片开封市中医院制剂室自制(批号分别为150630、160311、161218)；马钱苷对照品、莫诺苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为111640-201606、111998-201501)；色谱纯甲醇；乙腈(美国TEDIA天地试剂公司)；水为哇哈哈纯净水。

2　方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱条件：色谱柱为Thermo Scientific Hypersil ODS色谱柱(50 mm ×2.1 mm，5 μm)；流动相为水-乙腈梯度洗脱，程序为0～0.50 min，5%～75%乙腈；0.50～2.00 min，75%～95%乙腈；2.00～2.01 min，95%～5%乙腈；2.01～3.50 min，5%乙腈；流速为0.35 mL·min-1；进样体积为10 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子化(ESI)电离源；扫描方式为选择反应监测(SRM)，正离子模式。喷雾电压4500 V；加热毛细管温度(TEM)为270 ℃；鞘气流速30 psi；辅助气流速15 psi；碰撞气(CID)压力为1.0 mTorr；源内碰撞解离电压(Source CID)为10 V；马钱苷与莫诺苷的检测离子对分别选择：m/z 413.1/219.1和m/z 428.9/267.0，碰撞电压分别为：34、23 eV[5-7]。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称定马钱苷和莫诺苷对照品适量，置容量瓶中，加入甲醇溶液溶解，并定容至刻度，分别配制成马钱苷(1.0 mg·mL-1)和莫诺苷(1.0 mg·mL-1)的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取10片十一味益肾降糖片，研细，过三号筛，精密称定药片细粉1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇(v/v)，密塞，精密称定，加热回流1 h，放冷，再精密称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用80%甲醇稀释50倍，作为供试品溶液。

2.4 专属性

取空白溶剂(80%甲醇)，混合对照品溶液和供试品溶液，按2.1项下色谱及质谱条件进样，得到典型色谱图(见图1)，马钱苷出峰时间为1.74 min，莫诺苷出峰时间为1.65 min，杂质在化合物出峰位置没有干扰，证明方法的专属性良好。

2.5 线性关系

将马钱苷和莫诺苷对照品溶液按照1∶1的体积比例进行混合，得到马钱苷和莫诺苷质量浓度均为500 μg·mL-1的混合对照品溶液，再依次稀释，得到马钱苷和莫诺苷质量浓度均为10、50、200、500、1000、2000 ng·mL-1的混合标准系列溶液。分别精密吸取混合标准系列溶液10 μL，按照2.1色谱及质谱条件进样测定，以被测化合物的峰面积为纵坐标(Y)，相应浓度为横坐标(X)进行线性回归，绘制标准曲线，并得到相应的线性相关系数。马钱苷的线性回归方程：Y=9.65×10-3X+3.72×10-1(r=0.998 2)，定量下限为10 ng·mL-1；莫诺苷的线性回归方程：Y=3.18×10-3X+2.58×10-1(r=0.999 1)，定量下限为10 ng·mL-1。结果表明，马钱苷和莫诺苷分别在10～2000 ng·mL-1浓度范围和10～2000 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

取低、中、高3个浓度(10、500、2000 ng·mL-1)的混合对照品分别重复进样5次，进样量10 μL，按2.1项下色谱及质谱条件进行测定，记录峰面积。结果马钱苷的RSD分别为2.93%、2.54%、2.72%；莫诺苷的RSD分别为3.05%、2.91%、2.47%，表明该方法精密度较好。

2.7 稳定性试验

取同一批号样品，分别于0、3、6、12、24 h按2.1项下色谱及质谱条件进行测定。结果马钱苷和莫诺苷峰面积的RSD分别为2.33%、2.84%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

注：A.莫诺苷；B.马钱苷；Ⅰ.80%甲醇；Ⅱ.混合对照品；Ⅲ.供试品。图1　典型色谱图

2.8 重复性试验

分别取同一批号样品6份，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，测定供试品中马钱苷和莫诺苷的含量。结果马钱苷和莫诺苷峰面积的RSD分别为2.76%和3.12%，表明该方法重复性较好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品约0.5 g，分别精密加入马钱苷对照品溶液(1.0 mg·mL-1)425 μL和莫诺苷对照品溶液(1.0 mg·mL-1)460 μL，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱及质谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

2.10 样品测定

取3批十一味益肾降糖片，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，并按2.1项下色谱及质谱条件测定，计算各批十一味益肾降糖片中马钱苷、莫诺苷的含量，结果见表2。

表1　十一味益肾降糖片中马钱苷和莫诺苷的加样回收率(n=6)

表2　十一味益肾降糖片中马钱苷和莫诺苷的含量测定结果

3　讨论

糖尿病是临床常见的内分泌代谢疾病，发病率仅次于肿瘤和心血管疾病。中医药是抗糖尿病药物开发的重要来源。已经有大量实验研究了中药或植物药以及其有效成分对糖尿病及相关并发症的治疗作用[8]。随着越来越多的抗糖尿病中药的开发，对于其质量控制的要求也越来越高，从而更好地确保中药安全性、有效性和质量稳定性。薄层色谱法、HPLC法等已经成为中药质量控制应用较为广泛的方法，近年来，采用LC-MS/MS法作为中药质量控制的手段逐渐普及，该法更加快速、灵敏，具有更好的特异性。

通过优化液相和质谱参数，发现采用Thermo Scientific Hypersil ODS色谱柱(50 mm × 2.1 mm，5 μm)和以水-乙腈为流动相进行梯度洗脱，可以获得合理的出峰时间、良好的峰形和分离度。质谱检测采用马钱苷和莫诺苷的[M+Na]+峰，获得了较为稳定的质谱响应。

本文采用了LC-MS/MS方法测定十一味益肾降糖片中的马钱苷和莫诺苷含量，方法专属性好，分析速度快，操作简单，灵敏度高，为科学控制十一味益肾降糖片的质量提供了重要的参考，为其临床应用提供了有力的保障，并且为将来更加深入研究该方剂的体内过程奠定了基础。

[1]Rild S，Roglic G，Green A，et al.Globlal prevalence of diabetes estimates for the year 2000 and projedious for 2030[J].Diabetes Care，2004，27(6)：1047.

[2]熊山，叶祖光.楮实子化学成分及药理作用研究进展[J].中国中医药信息杂志，2009，16(5)：102-103.

[3]周羽，王镁.糖尿病中医病机研究进展[J].光明中医，2014，29(7)：1575-1576.

[4]刘丰林，杨娜，胡素英.十一味益肾降糖片质量标准研究[J].中医研究，2011，24(11)：24-26.

[5]华云鹏，雍太萍，宗宁峰，等.UPLC-MS/MS法同时测定安喘舒丸中腺苷和黄芪甲苷含量[J].中国现代中药，2016，18(8)：1055-1057.

[6]郝刚，王亚琼，俞蕴莉，等.UPLC-MS/MS 法测定苦楝皮、川楝子及其制品中川楝素含量[J].中国现代中药，2015，17(12)：1280-1283.

[7]李思蒙，金敏蓉，赵森淼，等.芫花药材中芫花酯甲和芫花酯乙UPLC-MS含量测定方法[J].中国现代中药，2014，16(12)：996-999.

[8]仝小林，刘文科，甄仲，等.糖尿病中医研究的历史、现状及展望[J].中国新药杂志，2011，20(21)：2044-2047.