段珊 ，窦玲玲 ，程帅帅 ，郭亚宁 ，庞朝友 ，马启峰 ，魏恒玲 ，范术丽 ，王寒涛，喻树迅*

（1.西北农林科技大学农学院，陕西杨陵712100；2.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

植物microRNA （miRNA）是1类长度约为21 nt的内源性无编码功能的单链小分子RNA[1]，通过降解靶基因或抑制其翻译在转录后的水平上调节基因表达[2]，从而广泛参与植物生长发育的一系列重要进程，包括调控根的形成和发育、叶形态发生和极性及植物幼年期到生殖期转变。同时，miRNA在植物对外界环境应答和非生物胁迫方面发挥重要的调控作用[3]。

棉花是我国最重要的经济作物之一,叶片是棉花最重要的源器官，叶片早衰严重影响棉产量和纤维品质，进而造成棉花减产[4]。叶片衰老是叶片发育的最后阶段，多种激素参与了这一过程的调控，乙烯[5]、脱落酸[6]、茉莉酸[7]和水杨酸[8]可加速叶片衰老，细胞分裂素[9]、生长素[10]和赤霉素[11]则延缓叶片衰老。

miR160在植物的发育过程中起到了重要的调控作用。在拟南芥中，miR160通过靶向调控ARF10、ARF16和ARF17，参与调控植物生长发育及生物胁迫等[12]。在大豆中，过表达gm-MIR160A可增加叶绿素含量，同时其靶基因GmARF和衰老标记基因下调，表明gma-miR160通过抑制靶基因表达对叶片的衰老进程进行负调控[13]。将普通野生稻MIR160f前体转入拟南芥，可使莲座叶数目减少，首次抽薹时间提前，表明MIR160f可能参与了植物花期的调控[14]。而在龙眼中，miR160及其靶基因不仅参与激素信号传导，还参与体细胞胚胎发生过程[15]。番茄的miR160a通过抑制其靶基因SLARF10可影响叶片的长出和早期果实的发育[16]。

棉属A组、D组和AD组基因组测序已经完成[17-19]，可通过 psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）预测miR160的靶基因。经分析其为核酸外切体组分RRP41-like（Ribosomal RNA-processing protein 41），它的功能需要进一步验证。

本研究利用拟南芥内源miR319a前体骨架[20]，构建了棉花miR160的过表达载体，通过农杆菌介导法转入拟南芥等方法，初步明确了ghr-miR160的作用，以期为棉花叶片衰老相关基因的研究提供新思路。

1　材料与方法

1.1　材料

棉花miR160及其靶基因GhRRP41L在叶片中的相对表达量分析所用材料为早熟早衰品种中棉所10号 （CCRI 10）和早熟不早衰品种辽4086（Liao 4086），种植于中国农业科学院棉花研究所（河南省安阳市）温室。拟南芥为哥伦比亚型，于本实验室温室种植，生长条件为22℃，16 h光照、8 h黑暗。pMD19-T载体购于TAKARA公司，pBI121载体为本实验室保存，大肠杆菌DH5α购于北京全式金有限公司，农杆菌菌株LBA4404A为本实验室保存。

1.2　取样方法

棉花子叶展平后，开始进行第1次取样，每隔1周取1次叶片，共取4次样，3个重复，于液氮中速冻后存于－80℃冰箱备用。

1.3　DNA及RNA提取

采用改良的CTAB法提取拟南芥基因组DNA[21]，并将其保存于－20℃冰箱备用。使用Small RNA Purification Kit（Sigma）进行 microRNA的提取，按照TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金公司）说明书进行反转录，microRNA及cDNA存于－20℃冰箱备用。RNA的提取参照多糖多酚类RNAprep pure plant kit（天根生化科技有限公司）说明书，应用微量分光光度计和1%（质量分数）琼脂糖凝胶进行浓度和质量检测，合格的样品使用 PrimeScriptRT reagent kit（TaKaRa）合成 cDNA模板后，于－20℃保存或直接用于反转录实时荧光定量聚合酶链式反应 （Quantitative reverse transcription polymerase chainreaction，qRT-PCR）。

1.4　MicroRNA160过表达载体的构建

从 miRBase （http://www.mirbase.org/，release 21）获取拟南芥pre-miR319a序列，将ath-miR319a和ath-miR319a*替换为ghr-miR160和ghr-miR 160*，再从拟南芥pre-miR319a上下游各取80 bp碱基，新的序列送于苏州金唯智生物科技有限公司合成。以合成序列为模板，用AtmiR319a引物及 Mighty Amp○RDNA Polymerase Ver.2（TaKaRa）酶获得所需序列后，回收目的片段并连接pMD19-T载体，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，用菌液PCR方法鉴定获得阳性克隆，送至金维智公司进行测序。

对序列正确的菌液提取质粒检测后与经过双酶切 （酶切位点分别是BamHⅠ和SacⅠ）的pBI121载体进行重组，转化大肠杆菌DH5α，用测序验证正确的大肠杆菌重组质粒转化农杆菌。

1.5　MicroRNA160过表达载体转化拟南芥

利用Bechtold等建立的蘸花法转化拟南芥[22]。待种子成熟后收获，为T0种子，消毒灭菌后种于具卡那霉素抗性的1/2 MS培养基，于4℃冰箱春化2 d后，移至16 h光照、8 h黑暗，21℃的培养箱中，生长14 d后，将其移栽至营养土中。待拟南芥生长约40 d，取莲座叶进行PCR检测，分单株收获阳性株，为T1种子，以此类推，直至T3纯合株系。选取阳性纯合株系，进行ghr-miR160的转录水平分析及表型观察。

表1　引物序列Table 1　The primer sequences in this study

1.6　qRT-PCR分析

利用软件Oligo7设计荧光定量引物（表1），以棉花叶片和拟南芥叶片的cDNA为模板，使用康为世纪的试剂盒UltraSYBR mixture with ROX在ABI7500 Real-time PCR system荧光定量仪上进行qRT-PCR分析，反应条件为3步法，扩增程序为：预变性 95℃ 10 min；95℃ 10 s；60℃ 30 s；72℃32 s；40个循环。每个样品技术重复3次，采用 2-△△Ct法，内参基因为GhU6 和GhActin。

2　结果与分析

2.1　MicroRNA160家族分析

在miRBase中共获得pre-miR160数据141条，miR160数据150条，分布在19个物种共41种植物中。利用DNAMAN对150条miR160数据进行多重序列比对 （图1-A），以棉花miR160为例，第11位、14位和16位的C、G和A碱基在所有miR160中高度保守。利用DNAMAN和i-TOL（http://itol.embl.de/index.shtml） 对 141 条pre-miR160数据进行系统进化分析 （图1-B），结果表明，棉花 miR160 和甜橙（Citrus sinensis）、木薯（Manihot esculenta）、葡萄（Vitis vinifera）、毛果杨（Populus trichocarpa）及番木瓜（Carica papaya）的miR160具有较高的同源性。

2.2　棉花miR160的表达模式分析

叶片衰老最显著的变化是颜色由绿变黄，且叶片颜色越黄，衰老程度越严重[23]。观察CCRI 10和 Liao 4086 在 4 个时期（7 d、21 d、35 d、49 d）的子叶表型，CCRI 10子叶生长35 d时颜色明显变黄，而同时期Liao 4086子叶并无明显的黄化表型（图2-A）。因此，此时期CCRI 10的衰老程度比Liao 4086更为严重。qRT-PCR测定ghr-miR160（图 2-B）及其靶基因GhRRP41L（图2-C）的相对表达量表明，在35 d的Liao 4086子叶中ghr-miR160表达量上调，GhRRP41L表达量下调，说明ghr-miR160可能通过作用于靶基因延缓子叶的衰老。

图1　miR160多重序列比对及进化关系分析Fig.1　Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of miR160 family

图2　棉花miR160及其靶基因GhRRP41L在CCRI 10和Liao 4086不同时期子叶中的相对表达量Fig.2　qRT-PCR analysis of ghr-miR160 andGhRRP41Lin CCRI 10 and Liao 4086 at different development stages

2.3　棉花miR160的功能验证分析

提取转ghr-miR160基因拟南芥株系LR-1、LR-2、LR-3和野生型拟南芥叶片的 DNA和RNA，进行PCR验证和表达量分析。在DNA水平，转ghr-miR160基因拟南芥的条带和阳性质粒条带位置相同，而阴性对照和野生型拟南芥无条带（图3-A），说明ghr-miR160基因已经插入拟南芥基因组中；在RNA水平，ghr-miR160在转该基因拟南芥株系中表达量显著上调45～390倍（图3-B），说明ghr-miR160已在拟南芥中转录表达。表型观察结果表明，转ghr-miR160基因拟南芥比野生型拟南芥要晚抽薹，晚开花，叶片衰老延缓（图 4-A）。 分别取生长 20 d、30 d、40 d和 50 d的转ghr-miR160基因和野生型拟南芥莲座叶，测定拟南芥衰老相关基因SAG12的表达量，同时测定叶绿素。结果表明，在拟南芥衰老进程中，SAG12的表达量总体呈逐渐上升趋势，在拟南芥生长的40 d和50 d，转该基因拟南芥SAG12的表达量低于野生型拟南芥（图4-B）。然而，拟南芥叶绿素含量随着叶片衰老总体呈下降趋势，在生长40 d和50 d时，转ghr-miR160基因拟南芥的叶绿素含量高于野生型拟南芥（图4-C）。

图3　转基因拟南芥阳性检测和ghr-miR160表达量变化Fig.3　The checking of transgenicArabidopsisby PCR and qRT-PCR of ghr-miR160

3　讨论

叶片衰老是植物叶片发育的最后阶段，在衰老过程中，叶绿素丧失，大分子物质如蛋白质、脂类、核酸等被降解，导致光合作用减弱，同时衰老组织的营养物质被运输到幼嫩组织和生殖器官中[24]。棉花叶片衰老是1个普遍性的问题，发生于各国的产棉区，导致棉花减产降质[4]。目前对于棉花叶片衰老的研究主要集中在生理生化指标上；因此，研究棉花早衰过程中的关键基因具有重要意义。

根据Zhang等[25]对71个物种37个miRNA家族研究表明，至少存在于10个不同物种的miRNA家族是高度保守的。本研究发现植物miR160基因在进化上高度保守，这与Zhang等[25]的研究一致。保守的miRNA基因往往形成复杂的调控网络，功能具有多样性[26]。在所有miR160分布中，玉米（Zea mays）、亚麻（Linum usitatissimum）、 小立碗藓 （Physcomitrella patens）、 木薯（Manihot esculenta）中分别发现 13 个、10 个、9 个和 8 个；而在菊芋（Helianthus tuberosus）、向日葵（Helianthus annuus）和小麦（Triticum aestivum）中分别发现1个。由此可见，miR160在低等植物和高等植物中都存在，是1个相对古老的家族；但是各个植物之间的存在数量有明显差别，说明miR160基因在进化中，有些旧的基因消失，也有些新的基因出现，导致其在基因组呈分散分布，也进一步说明miR160家族调控的复杂性和研究价值。

为了探究棉花miR160的表达模式，本研究利用qRT-PCR分析了CCRI 10和Liao 40864各时期子叶的ghr-miR160及靶基因GhRRP41L的表达量。ghr-miR160在Liao 4086在子叶生长35 d中表达量显著高于CCRI 10。Xu等[27]也发现在水稻灌浆后期，miR160在不早衰品种的叶片中优势表达。这表明ghr-miR160可能调控棉花叶片的衰老。

目前，对于miR160的研究主要集中于其在种子萌发、根冠发育及响应逆境等方面的作用[12]。为了进一步验证miR160在叶片衰老中的功能，用ghr-miR160过表达载体转化拟南芥。在叶片衰老过程中，一些基因被激活，表达增强，此类基因为衰老相关基因[28]。qRT-PCR检测拟南芥衰老相关基因SAG12表达量结果显示，生长40 d的野生型拟南芥的SAG12表达量约为转ghr-miR160基因拟南芥的2倍，而至50 d时高达5倍。并且拟南芥生长40 d、50 d时，转ghr-miR160基因拟南芥叶绿素含量约为野生型拟南芥的18倍。以上结果表明，转ghr-miR160基因拟南芥的衰老速度远远低于野生型拟南芥。张停停[29]发现miR160的靶基因ARF16突变体可使拟南芥提前衰老。以上研究表明，miR160负调控叶片衰老。

4　结论

通过对ghr-miR160进行生物信息学分析、棉花子叶表达模式分析及过表达载体转化拟南芥验证分析，结果表明：其在进化过程中高度保守，且在35 d的早熟不早衰品种辽4086子叶中优势表达；转该基因拟南芥出现晚抽薹、晚开花和叶片衰老延迟现象。测定拟南芥叶片SAG12相对表达量和叶绿素含量结果进一步表明，转该基因拟南芥出现衰老延缓现象。以上结果初步证明棉花miR160基因可能对叶片衰老过程进行负调控，为miRNA在叶片衰老进程中发挥调控作用机制提供了新的思路，也为棉花分子育种提供了潜在的候选基因。

图4　转ghr-miR160基因拟南芥衰老延缓表型及相关指标测定Fig.4　PhenotypefordelayedleafsenescenceandresultsofrelateddetectioninArabidopsisoverexpressedghr-miR160

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