吴涛，沈叶，王文杰，黄忠明，王时光，瞿军

喉返神经损伤是甲状腺手术常见的并发症之一，损伤方式有多种，如挤压、结扎、烧灼及横断等[1]。损伤所致的声带麻痹可引起患者不同程度的声音嘶哑、失音、呛咳等症状，严重者可导致窒息而危及生命[2]。对于喉返神经损伤轻者可自行恢复，重者则永久麻痹[3]。目前即便在术中常规暴露喉返神经，术后仍会出现一过性或永久性声带麻痹，概率分别为5%～6%及1%～2%[4]。

神经营养因子是一类具有减少神经变性、促进神经分化再生、刺激轴突生长、阻止疾病进程的功能蛋白质[5,6]。脑源性神经营养 因 子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）可促进轴突的生长及再生，在维持神经系统中神经细胞的存活、分化、定向迁移等发挥重要作用[7,8]。虽然已有部分研究[9-12]，但就喉返神经损伤后的自我修复的研究仍较少。本研究拟通过建立大鼠单侧喉返神经挤压伤模型，研究喉返神经损伤术后其神经和喉内肌变化特征，明确神经损伤自愈程度，为喉返神经修复提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠30只（体质量340～360 g，12周），随机分为实验组和对照组各15只。动物伦理遵守上海市奉贤区中心医院伦理委员会相关规定。

1.1.2 主要试剂与仪器 BF-1T160喉镜（购于日本Olympus公司）；环氧树脂包埋剂、甲苯胺蓝（购于美国Sigma公司）；E600光学显微镜（购于日本Nikon公司）；BDNF抗体（购于美国Abcam公司）。

1.2 方法

戊巴比妥钠腹腔麻醉（40 mg/kg）后大鼠取仰卧位，固定四肢。备皮，消毒，铺巾，颈前正中垂直切口1 cm，分离颈前带状肌，在气管食管沟处暴露右侧喉返神经，实验组在距右侧喉返神经入喉1 cm处挤压长度为5 mm的喉返神经，对照组仅暴露神经。彻底止血，检查器械及纱布无误后逐层缝合颈部切口。通过纤维喉镜检查确定右侧声带是否固定，若未固定，则将该动物剔除。术后所有大鼠常规饲养。

1.3 检测指标

1.3.1 术后一般情况观察 术后观察大鼠有无发热、切口感染、死亡等情况发生。

1.3.2 发声功能评估 术后1 d、4周、8周、12周时，在6、12、18点三个时刻，针刺2组大鼠右后肢刺激其发声，使用录音笔记录30 s的发声音频。由于GRBAS标准对声样分级中总嘶哑度（grade，G）的评定结果最为稳定且可靠[13]，所以选择两位研究者独立评估同一声样的G值，若两者意见不符，则取第三人所评估G值作为最后结果。G值分为四级：正常为0级，轻度为1级，中度为2级，重度为3级。

1.3.3 杓状软骨运动评估 术后4周、8周、12周时，通过喉镜观察2组大鼠杓状软骨运动情况（图1A）。截取杓状软骨最大开放角度的图片，通过PS CC软件分析测量两侧杓状软骨间夹角度数。

1.3.4 喉返神经挤压处轴突数目计数 术后4周、8周、12周时，随机选取2组各5只大鼠，过量戊巴比妥钠麻醉处死（120 mg/kg），距离右侧喉返神经入喉处1 cm，近心端切取5 mm神经标本。神经标本放置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定3 d，1%四氧化锇固定24 h，通过梯度丙酮（30%、60%、90%、100%、100%、100%）脱水各20 min，环氧树脂812包埋，待树脂硬化后使用超薄切片机切取厚度为1 μm切片，1%甲苯胺蓝染色。光学显微镜下观察并拍照（图2A），使用PS CC软件计数。

1.3.5 甲杓肌中BDNF表达水平评估 术后4周、8周、12周时，取下2组大鼠全喉，在解剖显微镜下解剖甲杓肌。经过组织固定、脱水、石蜡包埋后，切取厚度为4 μm的组织切片进行免疫组化染色。滴加BDNF抗体（1∶75）过夜孵育后，加入二抗经DAB显色后拍照（图3A），通过Image Pro Plus 6.0分析BDNF表达情况，计算相对光密度，相对光密度=实验组IOD/对照组IOD。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

30只大鼠术后全部存活，无发热、切口感染等情况发生。

2.2 发声功能

对照组大鼠声音清脆、尖锐，G0。实验组术后1 d发声嘶哑、无力，G3；术后4周声音嘶哑较前有好转，G2；术后8周有较大改善，声音略低沉，G1；术后12周声音比较尖锐，主观评估与对照组无差异，G0。

2.3 杓状软骨运动角度

对照组两侧杓状软骨运动对称，最大角度可达（42.11±10.91）°。实验组喉返神经挤压伤后即刻出现声带固定，术后4周时右侧杓状软骨瘫痪，左右不对称，最大角度为（23.11±4.99）°；术后8周时杓状软骨运动有改善，最大角度为（29.57±8.12）°；术后12周时杓状软骨运动恢复，开放最大角度为（37.98±3.56）°，此时与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05，图1B）。

2.4 轴突数目分析

对照组的喉返神经轴突数目为（225.59±7.51）；实验组的喉返神经损伤后轴突数目有所减少，术后4周为（212.33±8.91），术后8周为（216.25±7.49），术后12周为（220.81±12.58）（图2B）。实验组术后的轴突数目先减少，随时间延长有所增长，直到术后12周与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 甲杓肌中BDNF表达情况

实验组的BDNF在甲杓肌中的表达在喉返神经损伤后下降，随时间延长逐渐上升，术后4周相对光密度为（0.45±0.15）；术后8周时为（0.71±0.19）；术后12周时为（1.20±0.11），与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05，图3B）。

注：A为喉返神经损伤后杓状软骨运动情况，可见右侧有瘫痪；B为杓状软骨开放最大角度分析，随术后时间延长，最大角度逐渐增大（n=15）。与对照组比较，①P＜0.05

3 讨论

喉返神经损伤修复的研究是当前研究的热点之一。临床上由于各种原因而导致喉返神经麻痹的病例很多，可引起患者发音和呼吸功能障碍[4]；如何使去神经的喉内肌恢复神经化，是治疗关键。目前，喉返神经损伤修复的方法有甲状软骨成形术、杓状软骨内手术、喉返神经端端缝合术及神经肌蒂移植术等，虽然有一定的临床意义，但术后神经功能恢复效果仍不佳[14]。明确喉返神经挤压损伤后其病理生理变化情况对指导神经修复有重要意义。

喉内肌由喉返神经及喉上神经外支支配，喉返神经支配除环甲肌之外的所有喉内肌[15]。甲杓肌作为喉内肌，在发音和呼吸中发挥重要作用，且它是喉返神经损伤后最容易受到影响的肌肉，所以本研究选取甲杓肌为研究对象[16]，观察神经受损后甲杓肌中BDNF的表达变化。当喉返神经损伤后，由于甲杓肌失去支配该肌的神经的营养作用，其结构和功能也发生很大的变化。本研究发现实验组喉返神经挤压伤后，即刻出现声带固定，在观察时间内，随着时间的延长，声带运动、发声、轴突数目均逐渐改善，直到术后12周恢复正常。结合BDNF表达量的分析，笔者推断，由于挤压伤较横断伤而言，损伤较轻，在术后随着缺少的神经营养因子的不断补充等自发性修复的发生，使得肌肉得到相应的神经化，进而喉功能得到改善。

挤压伤属于神经损伤Sunderland分级中的2级，是一种主要造成轴突损伤的形式[14]。众所周知，神经损伤形式及神经轴突的数目与神经损伤后修复密切相关[17]。喉返神经挤压伤后，由于局部缺血、电解质浓度变化等因素，导致髓鞘破坏并使轴突的再生受到抑制[14]。虽然挤压伤不是神经最严重的损伤形式，但可以模拟手术中所造成的轴索断裂损伤[18]。研究发现受到挤压的喉返神经的神经再生随时间延长而逐渐改善，直到术后12周神经轴突数目达到对照组水平，表明神经挤压伤后存在一定的自我修复功能。

肌肉由神经支配，肌纤维的成熟、分化及维持成熟肌纤维正常的结构和功能均依赖于神经所分泌的神经营养因子，肌纤维去神经支配后由于神经营养因子丢失导致肌肉发生一系列变化，如新陈代谢、形态结构及生理生化等[9]。BDNF可促进轴突生长、神经存活及塑形[19]，本研究发现喉返神经挤压伤术后，BDNF在4周时有明显降低，之后呈上升趋势，其变化特点与神经再生的恢复类似，表明BDNF表达水平与神经修复密切相关，应用外源性神经营养因子有可能促进神经修复进程。

本研究存在一定局限性，如动物样本量小、术后观测时间较短，只测定一种神经营养因子的表达水平，后续应增加神经因子种类，研究它们在神经再生过程中的变化趋势，并进一步量化分析。本研究表明，大鼠单侧喉返神经挤压伤后有一定自我恢复能力，其神经所支配的生理功能得到改善，BDNF表达水平与神经修复过程息息相关。

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图2 喉返神经轴突数目分析

注：A为神经断端（甲苯胺蓝染色，×100）。B为神经断端轴突数目分析图，喉返神经损伤术后其轴突数目先减少，随时间延长有所增长（n=15）。与对照组比较，①P＜0.05

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