翟学萍,　尤慧艳(1. 大连大学环境与化学工程学院, 辽宁 大连 116622; 2. 中国科学院烟台海岸带研究所, 山东 烟台 264003)

拉曼光谱成像技术具有灵敏度高、多元信号识别能力强等优势,近年来在分子检测、疾病诊断等领域受到了广泛关注[1]。研发拉曼信号强、光学性质稳定的表面增强拉曼散射(SERS)探针是实现拉曼成像的前提和基础。传统的SERS探针主要由金(Au)、银(Ag)等贵金属纳米粒子和其表面结合的拉曼报告分子两部分组成。贵金属纳米粒子为拉曼信号增强基底,报告分子则赋予SERS探针特征散射谱峰,二者的光学性质对SERS探针的信号强度具有决定性影响[2,3]。

内标化SERS探针是最近发展起来的一类新型纳米光学探针[4,5],其报告分子镶嵌于SERS探针结构内部[6,7],有别于传统SERS探针中报告分子吸附于贵金属纳米基底外层的结构。内标化SERS探针一般以金纳米球(AuNPs)或金纳米棒(AuNRs)为核心,在其表面修饰报告分子,进一步在复合物表面生长Au或Ag壳层,形成AuNP@Au[8-10]、AuNR@Ag[11-13]等核壳纳米结构。该设计不仅能显著提高信号强度,也可以提高探针在生物基质中的稳定性,避免报告分子解离和内源物质干扰所造成的信号变化[14]。此外,壳层贵金属的外表面裸露,可进一步吸附待测分子生成SERS信号,实现后续免标记传感[15-17]。

内标化探针的壳层种类对探针的性质具有重要影响。基于Au壳的内标化SERS探针生物相容性好[18],但其壳层厚度不易精确控制,灵敏度也较低;基于Ag壳的内标化探针虽然生物相容性较差,但其合成方法简单,壳层厚度可以精确调控[19]。而且Ag的拉曼增强能力优于Au,其信号灵敏度较Au壳包裹的探针高数十倍,在活体深层次检测中展示了更大的优势[20]。因此,基于银纳米材料探针的研发仍然是近年来的热点方向,值得注意的是,银层包覆内标化SERS探针一般在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)体系中合成,形成的探针表面会吸附CTAB，其细胞毒性较大[21],导致探针难以直接用于生物标记。此外,Ag壳层的化学性质较Au更为活泼,其氧化和溶解现象容易引起SERS探针的结构和信号变化[22-24]。

为了克服Ag壳内标化SERS探针的上述缺陷,发挥其高灵敏度的成像优势,本研究在合成以4-硝基苯硫酚(NT)为报告分子的Au@NT@Ag内标化SERS探针的基础上,进一步以牛血清白蛋白(BSA)置换探针表面的CTAB,发展了Au@NT@Ag@BSA内标化SERS探针。实验发现,Au@NT@Ag@BSA探针既保留了原探针的单分散性和高灵敏度,又显著提高了探针的信号稳定性和生物相容性。进一步将Au@NT@Ag@BSA探针和SMMC7721肺癌细胞共孵育,实现了细胞的探针标记和激光共聚焦显微拉曼光谱成像。研究表明,Au@NT@Ag@BSA内标化SERS探针在活体生物成像等方面展示了良好的应用潜力。

1　实验部分

1.1　仪器与试剂

s-4800扫描电子显微镜(日本Hitachi公司), RFS 100DXR激光共聚焦显微拉曼光谱仪、FT/IR-4100傅里叶变换红外光谱仪、2000/2000C紫外-可见分光光度计、FORMA STERI-CYCLE培养箱(美国Thermo Fisher公司), Nano-ZS90马尔文电位-粒度分析仪(英国Malvern公司), InfiniteM200全功能酶标仪(帝肯上海贸易有限公司), H1650-W台式微量高速离心机(湘仪仪器有限公司), KQ-250TDB超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)。

氯金酸(HAuCl453H2O)、硝酸银(AgNO3)、硼氢化钠(NaBH4)、氢氧化钠(NaOH)和抗坏血酸(AA)均购自国药集团化学试剂有限公司,CTAB、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、NT、柠檬酸钠、二甲亚砜(DMSO)和氮蓝四唑盐(MTT)均购自阿拉丁试剂有限公司,BSA购自北京索莱宝科技有限公司,SMMC7721肺癌细胞购自中科院上海细胞库，DMEM培养基购自美国Hyclone公司,胎牛血清(灭活)购自美国Gibco公司,胰酶消化液、磷酸盐缓冲液(PBS)购自赛尔斯(中国)生物科技有限公司。

实验所用玻璃仪器均用新配制的王水HCl-HNO3(3∶1, v/v)清洗;实验所用的水均为二次纯化后的超纯水(18.2 MΩ5cm)。

1.2　AuNPs的制备

根据文献报道[25]采用种子生长法合成16 nm AuNPs。

种子的合成：将5 mL HAuCl4(0.5 mmol/L)和5 mL CTAB(200 mmol/L)混合搅拌均匀,向其中加入600 μL冰水配制的NaBH4溶液(10 mmol/L),搅拌,待溶液颜色由亮黄色变为棕色后停止搅拌,静置3 h。

金纳米球的合成:向2 mL CTAC(200 mmol/L)与1.5 mL AA(100 mmol/L)的混合溶液中加入20 μL种子,再加入2 mL HAuCl4溶液(0.5 mmol/L),于27 ℃搅拌15 min,得到16 nm AuNPs。

1.3　内标化Au@NT@Ag SERS探针的制备

取1 mL 16 nm AuNPs离心水洗2次(13 000 r/min, 15 min),弃去上清液,重新分散在1 mL去离子水中。向上述溶液中加入50 μL 1 mmol/L NT溶液,使NT报告分子的终浓度为0.05 mmol/L,超声15 min。然后取1 mL所得溶液加入200 μL CTAB溶液(200 mmol/L),以13 000 r/min离心15 min,弃去上清液,并用1 mL CTAB溶液(200 mmol/L)重新分散。所得溶液以13 000 r/min离心15 min,采用CTAB溶液(200 mmol/L)分散,重复此操作3次,最后分散在1 mL去离子水中,既得NT结合的金纳米球(Au@NT)。

进一步在Au@NT粒子表面包覆银层,借鉴文献[26]方法,分次加入不同体积的生长液。取1 mL Au@NT溶液,加入1 mL CTAB溶液(200 mmol/L),搅拌均匀,依次加入30 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L),然后用NaOH溶液(100 mmol/L)将反应体系的pH值调节至10,反应5 min，得到Au@NT@50Ag SERS探针。

另取一份Au@NT溶液采用上述相同的方法制得Au@NT@50Ag后,继续向其中依次加入20 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L),再用NaOH溶液调节反应体系的pH值至10,搅拌5 min后得到Au@NT@100Ag SERS探针。重复此操作,直至AgNO3溶液加入的体积达到300、500、700和1 000 μL,得到Au@NT@300Ag、Au@NT@500Ag、Au@NT@700Ag和Au@NT@1000Ag SERS探针。

1.4　外标化Au@Ag@NT探针的制备

取1 mL 16 nm AuNPs离心水洗2次(13 000 r/min, 15 min),弃去上清液,重新分散于1 mL去离子水中,向其中加入1mL CTAB(200 mmol/L)溶液,搅拌均匀,依次加入30 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L),然后用NaOH溶液(100 mmol/L)将反应体系的pH值调节至10,反应5 min，得到Au@50Ag纳米粒子。按照1.3节方法继续生长Ag层,得到Au@300Ag纳米粒子。离心水洗之后分散于950 μL去离子水中,加入50 μL 1 mmol/L的NT溶液,使NT报告分子的终浓度为0.05 mmol/L,超声15 min,然后加入200 μL CTAB(200 mmol/L)溶液,离心,弃去上清液,加入1 mL去离子水分散,备用。

1.5　Au@NT@Ag@BSA探针的制备

称取0.5 g BSA,溶于50 mL去离子水中,使BSA的终浓度为0.147 mmol/L,加入0.01 g柠檬酸钠,用NaOH溶液调节体系的pH值至7,备用。另外称取0.05 g BSA,溶于50 mL去离子水中,使BSA的终浓度为0.014 7 mmol/L,加入0.01 g柠檬酸钠,用NaOH溶液调节体系的pH值至12,备用。

取1.3节制备的Au@NT@700Ag SRES探针溶液1 mL,离心(5 800 r/min, 8 min),弃去上清液,分散于1 mL pH 7的去离子水中,将所得溶液逐滴加入3 mL pH 7的BSA溶液中,搅拌均匀,超声30 min,然后离心(5 800 r/min, 8 min),分散于1 mL pH 12的BSA溶液中,静置2 h,最后离心(5 800 r/min, 8 min),用pH 12的去离子水洗一次,分散于去离子水中并浓缩至500 mg/L。Au@NT@Ag@BSA SERS探针的合成过程见图1。

1.6　MTT比色法测SERS探针的细胞毒性

培养肺癌SMMC7721细胞至对数期,胰蛋白酶将其消化制成单细胞悬浮液,显微镜下计数,接种于96孔板,调节细胞含量为7×103个/孔,每孔加入200 μL细胞培养基,置于含5%(体积分数)CO2的细胞培养箱内,于37 ℃下培养24 h,使其贴壁。

培养24 h后,观察细胞生长状态。设置调零组、空白对照组和加样组,调零组不添加任何试剂,空白组加入20 μL灭菌水,加样组分别加入20 μL系列质量浓度(5、10、100和300 mg/L)的两种SERS探针(Au@NT@Ag与Au@NT@Ag@BSA)溶液,每个质量浓度设5个复孔,置于细胞培养箱内,于37 ℃培养24 h。

培养24 h后,每孔加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT溶液,放入培养箱中继续孵育4 h,弃去上清液,每孔加入200 μL DMSO,置于摇床上振摇10 min,直至结晶完全溶解,用酶标仪测定570 nm处的吸光度A570, 5个复孔取平均值。细胞存活率=A实验组/A对照组×100%。

1.7　细胞成像

培养SMMC7721细胞至对数期,胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,稀释后于显微镜下观察计数,于24孔板中调节细胞含量为1.2×104个/孔,每孔加入500 μL细胞培养基,于37 ℃细胞培养箱内培养12 h。培养12 h后,前12个孔分别加入100 μL Au@NT@Ag探针,后12个孔分别加入100 μL Au@NT@Ag@BSA SERS探针,使二者的质量浓度均为50 mg/L,共培养3 h后,用PBS清洗细胞两遍,置于玻璃片上密封,在拉曼显微镜下观察细胞形态,记录细胞不同区域的拉曼信号。

2　结果与讨论

2.1　Au@NT@Ag SERS探针的表征

对Au@NT@Ag SERS探针进行了理化性质和光学性质表征。采用冷场发射扫描电子显微镜测定,得到的结果显示,AuNPs的粒径约为16 nm,且分布均匀(见图2a)。Au@NT@Ag的冷场发射扫描电子显微镜结果显示,Au@NT@Ag近球形,且结构均匀,粒径大小约为60 nm(见图2b)。马尔文电位-粒度仪测试SERS探针结果显示,探针的水合粒径约为79 nm,平均Zeta电位为28.9 mV,表明探针表面吸附了阳离子表面活性剂CTAB。

采用紫外-可见分光光度计和激光共聚焦显微拉曼光谱仪对Ag层的生长过程进行监测。结果显示,随着AgNO3加入体积的增加,银层逐渐变厚,内标化SERS探针的紫外吸收峰显示了先蓝移后红移的过程,紫外吸收峰强度从0.18增加到1.17(见图3a)。图3b为加入不同AgNO3体积后制备的探针的激光共聚焦显微拉曼光谱图,可以看出报告分子NT在1 568、1 328和1 078 cm-1等处有特征峰。当AgNO3的加入体积从50 μL增加到700 μL时,SERS探针的拉曼信号逐渐增强,并在700 μL时达到最大。这是由于相较于Au纳米粒子,Ag层包裹后具有更好的拉曼增强效应[27]。当AgNO3的加入体积进一步增加到1 000 μL时拉曼信号出现降低趋势,可能是因为形成的Ag层过厚,对激发光的遮挡效应大于报告分子信号的增强效应,因此拉曼信号出现降低趋势[28]。因此选择Au@NT@700Ag作为SERS探针进行下一步研究。

图 3　AuNPs和加入不同体积AgNO3制备的Au@NT@Ag内标化SERS探针的(a)紫外吸收光谱图和(b)拉曼光谱图　Fig. 3　(a) UV absorption spectra and (b) Raman spectra of AuNPs and Au@NT@Ag tags by adding different volumes of AgNO3 solution Au@NT@50Ag, Au@NT@100Ag, Au@NT@300Ag, Au@NT@500Ag, Au@NT@700Ag and Au@NT@1000Ag were tags by adding 50, 100, 300, 500, 700 and 1000 μL of AgNO3 solution (10 mmol/L), respectively.

实验比较了内标化Au@NT@Ag和外标化Au@Ag@NT两种探针的信号强度。以AgNO3加入体积300 μL为例,外标化Au@Ag@NT探针在1 328 cm-1特征峰处信号强度约为220,内标化Au@NT@Ag探针的信号强度约为1 100,较前者显著提高。内标化探针的高灵敏度性质为后续成像应用奠定了基础。

2.2　Au@NT@Ag@BSA的表征

BSA生物相容性良好,并且分子结构中有二硫键和丰富的氨基、羧基等活性基团作为多价配体,具有比单价配体CTAB更强的金属结合力[29-32],因此尝试用其置换内标化Au@NT@Ag SERS探针表面的CTAB。首先将探针离心,用pH 7去离子水分散,使粒子表面CTAB浓度降至临界胶束浓度以下。然后采用pH 7和pH 12的BSA溶液各进行一次置换后,再用pH 12的去离子水清洗并浓缩至原浓度。

第一次置换过程中选择高浓度BSA是十分必要的,整个过程中高BSA-CTAB浓度比率有利于平衡向着BSA包覆纳米粒子的方向转移[33]。实验中将浓度为0.147 mmol/L的BSA与探针溶液按体积比1∶1和2∶1混合,探针会发生不同程度的团聚,探针粒子Zeta电位依然表现为CTAB的正电荷(35.5 mV和11.4 mV)。将二者体积比提高至3∶1,混合体系中粒子分散性良好,Zeta电位下降至BSA的负电位(-25.7 mV),表明粒子表面CTAB被BSA大量置换。第二次置换过程将BSA溶液的pH调节至12,主要原因是BSA等电点为4.8,在pH 12时呈现明显负电荷(约-35 mV)[30],有利于提高置换后粒子的单分散性。此外,游离态BSA易与带正电的CTAB通过静电结合作用形成复合物,便于在后续离心过程中将CTAB去除。

通过多种手段对置换过程进行验证。冷场发射扫描电子显微镜结果显示,BSA均匀包覆于Au@NT@Ag SERS探针表面且未造成纳米粒子团聚(见图4a)。水合粒径及电位分布测定结果显示,BSA置换使探针粒子的水合粒径由79 nm增大到88 nm,电位由28.9 mV转变为-25.7 mV。傅里叶变换红外光谱表明,BSA包覆的Au@NT@Ag粒子出现了1 450、1 392和1 245 cm-1等BSA的红外特征吸收峰(见图4b)。以上结果均表明BSA被成功包覆于内标化Au@NT@Ag SERS探针表面。

图 4　(a)Au@NT@Ag@BSA探针的扫描电子显微镜图和(b)BSA、Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探针的红外光谱图　Fig. 4　(a) SEM image of Au@NT@Ag@BSA tags and (b) FT-IR spectra of BSA, Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA tags

图 5　Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探针的(a)紫外吸收光谱图及实物图和(b)拉曼光谱图Fig. 5　(a) UV absorption spectra, photographs and (b) SERS spectra of Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA tags

进一步对BSA包覆的内标化SERS探针进行光谱性质表征。图5a显示,BSA包覆前后二者的紫外-可见吸收光谱的峰强度没有发生明显变化,包覆BSA探针的紫外峰形略微变宽且红移,这可能是由于纳米粒子界面折射系数发生了改变[34,35]。激光共聚焦显微拉曼光谱测定结果显示,BSA包覆过程未对探针的拉曼光谱强度及特征峰位造成明显改变(见图5b)。

2.3　SERS探针的稳定性和细胞毒性考察

图 6　Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探针30 d内的拉曼信号强度(n=3)Fig. 6　Raman intensity for the Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA tags within 30 d (n=3)

CTAB体系是Au@NT@Ag粒子中Ag层生长的必要条件,Au@NT@Ag粒子生成后表面包覆CTAB双层结构。在近中性条件下,Ag+/Ag、AgBr/Ag和O2/H2O的条件氧化还原电势分别为0.80、0.13和0.82 V,理论上讲,Br-的存在会促进溶解氧将银纳米粒子氧化溶解并最终形成AgBr。而BSA修饰的体系中,氧气和银层的接触概率较低,氧的条件氧化还原电位可能会低于0.80 V(Ag+/Ag)。溶解氧很难将银单质氧化溶解。为了验证这一假设采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪监测了Au@NT@Ag@BSA SERS探针30 d内1 328 cm-1处特征峰的信号强度,并以CTAB稳定的样品作对照。如图6所示,CTAB稳定的Au@NT@Ag探针拉曼信号持续下降,直至难以测出。由于BSA对Ag层的稳定和保护作用,Au@NT@Ag@BSA探针在30 d内显示了良好的稳定性。

图 7　与不同质量浓度的Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探针共培养24 h后SMMC7721细胞的存活率(n=5)　Fig. 7　Cell viability of SMMC7721 cells co-incubated with different mass concentrations of Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA SERS tags for 24 h (n=5)

进一步考察置换前后探针的细胞毒性。如图7所示,CTAB稳定的SERS探针Au@NT@Ag具有明显的毒性,细胞存活率随探针质量浓度的增加而迅速下降,在Au@NT@Ag探针的质量浓度为300 mg/L时细胞存活率已低于20%。BSA包覆后的SERS探针的细胞毒性明显降低,当Au@NT@Ag@BSA探针的质量浓度增加到300 mg/L时,细胞存活率仍维持在75%以上。上述结果表明,BSA置换可以有效消除Au@NT@Ag探针的急性毒性效应,但Ag壳的慢性毒性由于银离子缓释等原因难以避免。MTT比色法实验结果显示,在满足成像的Au@NT@Ag@BSA探针使用剂量下(50 mg/L),细胞保持了80%以上的存活率,结果令人满意。一定程度上解决了以往Au@Ag内标化SERS探针生物相容性差这一瓶颈问题,为后续活细胞成像应用提供了前提。

2.4　细胞拉曼成像结果

分别将Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA SERS探针与SMMC7721细胞共培养3 h,采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪50倍显微镜下观察细胞的生长状态及SERS探针分布情况,检测SERS探针的拉曼信号强度。观察结果表明,3 h后纳米粒子经吞噬作用进入细胞,如图8a显示,与Au@NT@Ag@BSA探针共同孵育的细胞状态良好,细胞内能够清晰地观察到大量的纳米粒子分布。比较而言,由于CTAB的细胞毒性效应,与Au@NT@Ag探针共培养后,细胞数目明显下降,且细胞内部探针颗粒较少(见图8b),表明该探针标记细胞的能力较弱。以上结果初步验证了Au@NT@Ag@BSA探针在成像分析中的适用性。

本研究通过反射光斑的大小,粗略估计细胞不同位置处粒子的数目差别,进一步将其和该处的拉曼信号强度进行比较,通过拉曼强度验证粒子分布的可行性和准确性。因此,进一步测定了单个细胞中不同位点的拉曼信号强度。如图9a所示,Au@NT@Ag@BSA SERS探针信号集中在细胞质区域,与明场照片(见图9a内插图)中颗粒出现部位呈现明显的对应;Au@NT@Ag探针在细胞中也显示相同的结果,但整体拉曼强度降低近一个数量级(见图9b)。与细胞共培养后采用激光共聚焦显微拉曼仪对3个细胞进行成像结果显示,Au@NT@Ag@BSA探针的摄取没有影响细胞的形貌和生长状态(见图9c),通过基于1 328 cm-1特征信号强度的拉曼成像图(见图9d)可知,BSA包覆的探针对细胞具有良好的整体成像效果。

3　结论

本研究设计合成了BSA包覆的内标化SERS探针Au@NT@Ag@BSA,该探针具有良好的信号稳定性和生物相容性。研究借助激光共聚焦显微拉曼光谱仪的采集和成像功能,实现了探针对SMMC7721肺癌细胞的定位和标记。研究结果表明,内标化Au@NT@Ag@BSA SERS探针在活体生物成像等方面展示了良好的应用潜力。

参考文献:

[1]Wang Y Q, Yan B, Chen L. Chem Rev, 2013, 113(3): 1391

[2]Zhang J W, Winget S A, Wu Y R, et al. ACS Nano, 2016, 10(2): 2607

[3]Yin H J, Chen Z Y, Zhao Y M, et al. Sci Rep, 2015, 5: 14502

[4]Li W B, Guo Y Y, Zhang P. J Phys Chem C, 2010, 114(16): 7263

[5]Zhang P, Guo Y Y. J Am Chem Soc, 2009, 131(11): 3808

[6]Yang T, Jiang J. Small, 2016, 12(36): 4980

[7]Zeng L Y, Pan Y W, Wang S J, et al. ACS Appl Mater Inter, 2015, 7(30): 16781

[8]Hu C Y, Shen J L, Yan J, et al. Nanoscale, 2016, 8(4): 2090

[9]Lim D K, Jeon K S, Hwang J H, et al. Nat Nanotechnol, 2011, 6(7): 452

[10]Zhang Y Y, Zhou W, Xue Y, et al. Anal Chem, 2016, 88(24): 12502

[11]Jiang T, Wang X L, Zhou J. Appl Surf Sci, 2017, 426: 965

[12]Lim D K, Kim I J, Nam J M. Chem Commun, 2008, 42: 5312

[13]Jin X, Khlebtsov B N, Khanadeev V A, et al. ACS Appl Mater Inter, 2017, 9(36): 30387

[14]Li J X, Zhu Z, Zhu B Q, et al. Anal Chem, 2016, 88(15): 7828

[15]Khlebtsov B, Khanadeev V, Khlebtsov N. Nano Res, 2016, 9(8): 2303

[16]Wan L P, Zheng R R, Xiang J. Vib Spectrosc, 2017, 90: 56

[17]Fales A M, Vo-Dinh T. J Mater Chem C, 2015, 3(28): 7319

[18]Guo X, Guo Z Y, Jin Y, et al. Microchim Acta, 2012, 178(1/2): 229

[19]Liu Y T, Zhou J, Wang B B, et al. Phys Chem Chem Phys, 2015, 17(10): 6819

[20]Gómez-Grana S, Pérez-Juste J, Alvarez-Puebla R A, et al. Adv Opt Mater, 2013, 1(7): 477

[21]Su X M, Wang Y Q, Wang W H, et al. ACS Appl Mater Inter, 2016, 8(16): 10201

[22]Li L Z, Wu H F, Peijnenburg W J, et al. Nanotoxicology, 2014, 9(6): 792

[23]Lok C N, Zou T T, Zhang J J, et al. Adv Mater, 2014, 26(31): 5550

[24]Han Y, Lupitskyy R, Chou T M, et al. Anal Chem, 2011, 83(15): 5873

[25]Zheng Y Q, Zhong X L, Li Z Y, et al. Part Part Syst Char, 2014, 31(2): 266

[26]Wang Y, Wang Y Q, Wang W H, et al. ACS Appl Mater Inter, 2016, 8(41): 28105

[27]Abalde-Cela S, Aldeanueva-Potel P, Mateo-Mateo C, et al. J R Soc Interface, 2010, 7(Suppl 4): S435

[28]Feng Y H, Wang Y, Wang H, et al. Small, 2012, 8(2): 246

[29]Chanana M, Rivera Gil P, Correa-Duarte M A, et al. Angew Chem, 2013, 52(15): 4179

[30]Strozyk M S, Chanana M, Pastoriza-Santos I, et al. Adv Funct Mater, 2012, 22(7): 1436

[31]Chanana M, Correa-Duarte M A, Liz-Marzan L M. Small, 2011, 7(18): 2650

[32]Tebbe M, Kuttner C, Mannel M, et al. ACS Appl Mater Inter, 2015, 7(10): 5984

[33]Ehlert S, Taheri S M, Pirner D, et al. ACS Nano, 2014, 8(6): 6114

[34]Yan B H, Wang Y Y, Wang Y C. J Phys Chem B, 1999, 107(34): 315

[35]Perezjuste J, Pastorizasantos I, Lizmarzan L M, et al. Coordin Chem Rev, 2005, 249(17/18): 1870

[36]Jiang X M, Miclaus T, Wang L M, et al. Nanotoxicology, 2014, 9(2): 181