张文娟,　宋乃忠,　贾　琼(吉林大学化学学院, 吉林 长春 130012)

蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,普遍存在于哺乳动物细胞中,对蛋白质的功能、结构有着重要影响,并在许多生理和病理过程中发挥着至关重要的作用。大量研究表明糖蛋白可以作为多种疾病的生物标记物[1,2]。质谱是分析蛋白质糖基化的强大工具,但大多数糖蛋白是低丰度蛋白质,难以达到质谱的灵敏度或存在质谱分析电离效率较差等问题[3]。因此,对复杂样本中的糖蛋白进行有效富集分离是实现高效糖蛋白鉴定的必要前提。常见的糖蛋白或糖肽富集策略包括凝集素亲和层析法[4]、硼酸亲和富集法[5]、肼化学富集法[6]和亲水作用色谱法[7]。由于聚合物整体柱具有渗透性高、稳定性高、传质速度快等优势[8],已被成功用于糖蛋白或糖肽的富集。为了提高富集选择性,通常对聚合物整体材料进行改性,改性材料包括金纳米粒子[9]、氧化石墨烯[10]和硼酸[11]等。

酞菁(Pcs)是一种具有18个π电子的大共轭体系化合物,由4个异吲哚亚基通过氮原子连接在一起[12]。酞菁分子环内有一个空穴,可以与70余种金属离子形成金属酞菁(MPc)[13]。金属酞菁及其衍生物已广泛应用于电化学传感[14]、气体传感[15]和光动力治疗药物[16]等。在酞菁环外周或者轴向位置引入各种取代基可以提高其在水和有机溶剂中的溶解度[17]。金属酞菁配合物可以和不同的分析物通过中心金属配位作用、π-π相互作用、氢键和范德华力结合[18]。Yu等[19]通过铜酞菁和功能单体之间的氢键作用合成了铜酞菁分子印迹聚合物,成功用于腐殖酸中酞菁类似物的分离;Candiano等[20]证实阿尔新蓝(具有外周取代酞菁结构的典型染料)能够特异性结合糖蛋白和糖胺聚糖。尽管酞菁在糖肽分离富集方面具有潜在能力[21],但根据文献调查表明,很少有研究报道酞菁在分离领域中的应用。

转铁蛋白(Tf)是血浆中主要结合并转运铁的糖蛋白,分子质量约为80 kDa,主要负责运载由胃肠道吸收的铁和由红细胞降解释放的铁[22]。在本工作中,将四羧基酞菁钴(CoPcTc)引入聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯)(GMA-EDMA)整体柱,作为聚合物整体柱微萃取(PMME)[23]的材料,并结合电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF MS)用于转铁蛋白糖肽的富集,并证明其具有很高的糖肽富集选择性。

1　实验部分

1.1　仪器、试剂与材料

Nicolet is5型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR, Thermo Nicolet公司,美国); microTOF-Q Ⅱ型电喷雾四极杆飞行时间质谱(Bruker Daltonics公司,美国); DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(上海羌强实业发展有限公司); LSP01-1A型注射泵(保定兰格恒流泵有限公司)。

GMA、EDMA、Tf(纯度≥98%)、牛血清白蛋白(BSA)、二硫苏糖醇、碘乙酰胺和胰蛋白酶(Sigma Aldrich公司,美国);环己醇、月桂醇、乙二胺、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和尿素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);丙酮、氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)、乙腈(ACN)、甲醇、偶氮二异丁腈(AIBN)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酸(FA)和碳酸氢铵(天津光复精细化工研究所);六水合氯化钴(CoCl256H2O)、钼酸铵((NH4)2Mo2O7)和偏苯三酸酐(郑州阿尔法化工有限公司);石英毛细管(530 μm,河北永年光纤厂)。所有试剂均为分析纯,实验用水为超纯水。

1.2　CoPcTc的合成

根据参考文献[24,25]制备CoPcTc:将充分研磨的1.50 g偏苯三酸酐、6.00 g尿素、0.06 g (NH4)2Mo2O7、1.38 g CoCl256H2O混合均匀,加入带有回流冷凝和搅拌装置的100 mL烧瓶中,搅拌条件下加热至160 ℃并保持3 h,然后继续升温至230 ℃反应6 h。将得到的固体用沸水洗至滤液无色,再将其用100 mL 2 mol/L NaOH溶液在100 ℃下水解12 h,静置、冷却至室温后,过滤,用浓盐酸调节滤液的pH值至2。静置过夜,过滤并收集沉淀,将得到的产物用大量的水、甲醇、丙酮清洗数次,最后于80 ℃真空干燥。

1.3　聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱的制备

首先根据文献报道[26]对毛细管管壁(20 cm×530 μm)进行硅烷化处理:依次用丙酮、1 mol/L NaOH、超纯水、1 mol/L HCl、水、丙酮各冲洗30 min。将含60%(v/v)γ-MAPS试剂的丙酮溶液注入毛细管中,两端用硅胶密封,置于烘箱中,于55 ℃加热14 h,用丙酮冲洗30 min,再用氮气吹干。

制备聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱包括以下3个步骤:(1)称取适量单体GMA(173 μL)和EDMA(114 μL)、致孔剂环己醇(655 μL)和月桂醇(70 mg)以及引发剂AIBN(4 mg),超声30 min,混合均匀,通入氮气10 min除去氧气和气泡。将上述得到的聚合反应液注入处理过的毛细管中,毛细管两端用硅胶密封,于60 ℃反应24 h。反应完成后,将得到的整体柱用甲醇冲洗，去除未反应的单体和致孔剂。(2)将乙二胺溶液以100 μL/min的流速通过预先制备的聚(GMA-EDMA)整体柱,30 min后将柱两端用硅胶密封,于70 ℃反应4 h[27]。反应完成后,用过量的水冲洗整体柱至中性。(3)将CoPcTc(10 mg)超声分散在0.5 mL DMF溶液中,然后加入DCC(13.24 mg),搅拌20 min,然后以50 μL/min的流速通过氨基修饰的聚(GMA-EDMA)整体柱,直至有蓝色溶液流出[28],然后用硅胶密封柱两端,在室温下反应24 h。将得到的聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱分别用甲醇和纯水冲洗。

1.4　样品前处理

称取1 mg标准转铁蛋白样品,溶解于1 mL 50 mmol/L碳酸氢铵溶液中,于95 ℃加热变性10 min,冷却至室温后加入10 mmol/L二硫苏糖醇,于56 ℃反应1 h,再加入20 mmol/L碘乙酰胺,在室温下于暗处反应45 min。按照底物:胰蛋白酶=30∶1的质量比加入胰蛋白酶,于37 ℃水浴条件下酶解16 h,然后在室温下加入2 μL甲酸终止反应。酶解液置于-20 ℃冰箱中保存备用[29]。

牛血清白蛋白和转铁蛋白的混合样品也按照上述方法进行处理。

1.5　糖肽富集

将0.3 mL上样溶液(含80%(v/v)ACN和0.1%(v/v)FA的水溶液)以30 μL/min的流速推过整体柱(3 cm),然后将0.4 mL转铁蛋白酶解液以10 μL/min的流速流经整体柱,再用2 mL上样溶液以50 μL/min的流速去除非糖肽。最后用解析液(含50%(v/v)ACN和0.1% (v/v)FA的水溶液)以4 μL/min的流速推过整体柱,收集解析液10 min,将得到的解析液通过质谱分析。

1.6　质谱条件

离子源:电喷雾电离源,正离子模式(ESI+);离子源温度:110 ℃;电喷雾电压:2.3 kV;扫描范围:m/z800～2 000;毛细管电压:3 500 V;碰撞解离能量:10 eV;去溶剂气体:氮气;去溶剂温度:200 ℃;去溶剂气体流速：8 L/min。

2　结果与讨论

2.1　CoPcTc加入量的选择

聚(GMA-EDMA)整体柱具有均一多孔的结构,有利于快速传质。当在聚合液中加入CoPcTc的含量为5 mg或10 mg时,整体柱的多孔结构依然存在;当CoPcTc的加入量超过15 mg时,用甲醇溶液冲洗时,发现整体柱的通透性变差。因此后续实验中采用加入10 mg CoPcTc制备的聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱。

图 1　(a) CoPcTc、(b)聚(GMA-EDMA)整体柱和(c)聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱的红外光谱图Fig. 1　FT-IR spectra of (a) CoPcTc, (b) poly(GMA-EDMA) monolith and (c) poly(GMA-EDMA-CoPcTc) monolith CoPcTc: cobalt phthalocyanine tetracarboxylic acid; GMA: glycidyl methacrylate; EDMA: ethyleneglycol dimethacrylate.

2.2　聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱的表征

CoPcTc、聚(GMA-EDMA)整体柱和聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱的红外光谱图见图1。如图1a所示,1 150、1 092、944和739 cm-1处的吸收峰为酞菁化合物的特征吸收峰,说明形成了酞菁大环结构[30]; 3 430 cm-1处的吸收峰属于 -OH的伸缩振动吸收峰;1 664和1 332 cm-1处的吸收峰属于C=O伸缩振动峰和C-O伸缩振动峰,证明合成的酞菁分子中含有羧基基团。如图1b所示,1 740 cm-1处的吸收峰属于GMA和EDMA分子上的C=O伸缩振动峰;图1c中新出现的1 652 cm-1处的吸收峰为整体柱上酰胺键的特征峰[31],证明CoPcTc已经成功键合在聚(GMA-EDMA)整体柱上。

2.3　聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱对转铁蛋白糖肽的富集

考察了聚(GMA-EDMA)整体柱和聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱对转铁蛋白酶解液中糖肽的富集性能。在富集前,由于非糖肽的质谱信号较强,抑制了糖肽的信号,只能得到4条糖肽。经过聚(GMA-EDMA)整体柱和氨基修饰的聚(GMA-EDMA)整体柱富集后,分别可以得到6条和7条糖肽,但是糖肽信号依然较弱。然而,经过聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱富集后,非糖肽的信号几乎已经消除,原本非常微弱的糖肽信号的峰强度有显著增强,共检测到17个糖肽信号,且发现多个富集前未能检测到的糖肽信号峰,具体的氨基酸序列见表1。CoPcTc能够提高对糖肽的富集能力,这主要是由于CoPcTc的钴原子能够和肽段之间产生配位作用,更重要的是CoPcTc结构中异吲哚基上的氮基团可以和糖肽形成氢键作用[20],从而提高了富集选择性。为进一步说明聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱对糖肽的富集选择性,用质量比为1 000∶1的牛血清白蛋白和转铁蛋白的混合物作为样品进行分析,富集前后分别得到2个和6个糖肽信号(见表1)。证明修饰的整体材料具有抗非糖肽信号干扰的能力。

表 1　标准转铁蛋白酶解液、牛血清白蛋白和转铁蛋白混合酶解液通过不同整体柱富集得到的转铁蛋白糖肽信息Table 1　Detailed information of glycopeptides enriched from transferrin (Tf) digests and the digests mixture of bovine serum albumin and transferrin by different monoliths　m/z

Tf: transferrin; BSA: bovine serum albumin. N*:N-glycosylation site.

实验进一步评估了聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱对糖肽富集的检测灵敏度,分别对浓度为1.8×10-9mol/L和8.8×10-10mol/L的转铁蛋白酶解液进行富集,结果见图2。

对于1.8×10-9mol/L的酶解液,得到6个糖肽信号;对于8.8×10-10mol/L的酶解液,其质谱图中依然可以观察到3个糖肽信号,说明本方法具有对微量样品分析的潜力。

图 2　聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱对(a)1.8×10-9mol/L和(b)8.8×10-10mol/L的转铁蛋白酶解液富集的质谱图Fig. 2　Mass spectra of (a) 1.8×10-9mol/L and (b) 8.8×10-10mol/L Tf digest after enrichment by poly(GMA-EDMA-CoPcTc) monolith Peak identifications were the same as those in Table 1.

3　结论

本文将CoPcTc引入到聚(GMA-EDMA)整体柱中,制备了新型的聚(GMA-EDMA-CoPcTc)整体柱,建立了一种PMME-ESI-Q-TOF MS的方法,成功用于转铁蛋白糖肽的富集。CoPcTc和糖肽之间的配位和氢键作用增强了糖肽的富集效率和选择性。本工作不仅提供了一种新的高效富集糖肽的材料,还进一步开拓了金属酞菁的应用领域。

参考文献:

[1]Chen R, Pan S, Brentnall T A, et al. Mol Cell Proteomics, 2005, 4(4): 523

[2]Fuster M M, Esko J D. Nat Rev Cancer, 2005, 5(7): 526

[3]Zhang X H, Wang J W, He X W, et al. ACS Appl Mater Inter, 2015, 7(44): 24576

[4]Shi Z M, Fan C, Huang J J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(2): 116

时照梅, 范超, 黄俊杰, 等. 色谱, 2015, 33(2): 116

[5]Chen M, Lu Y, Ma Q, et al. Analyst, 2009, 134(10): 2158

[6]Song E W, Zhu R, Hammoud Z T, et al. J Proteome Res, 2014, 13(11): 4808

[7]Malerod H, Rogeberg M, Tanaka N, et al. J Chromatogr A, 2013, 1317: 129

[8]Yang F, Mao J, He X W, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(6): 531

杨帆, 毛劼, 何锡文, 等. 色谱, 2013, 31(6): 531

[9]Liang Y, Wu C, Zhao Q, et al. Anal Chim Acta, 2015, 900(4): 83

[10]Zhou C Y, Chen X M, Du Z, et al. J Chromatogr A, 2017, 1498: 90

[11]Bie Z J, Chen Y, Li H Y, et al. Anal Chim Acta, 2014, 834(1): 1

[12]Lin Y Z, Li Y F, Zhan X W. Chem Soc Rev, 2012, 41(11): 4245

[13]Claessens C G, Hahn U, Torres T. Chem Rec, 2008, 8(2): 75

[14]Al-Sagur H, Komathi S, Khan M A, et al. Biosens Bioelectron, 2017, 92: 638

[15]Wang B, Wu Y Q, Wang X L, et al. Sensor Actuat B-Chem, 2014, 190(1): 157

[16]Zhou X L, Zheng K, Li R, et al. Acta Biomater, 2015, 23: 116

[17]Li Y H, Zhao D H, Li Y W, et al. Dyes Pigm, 2017, 142: 88

[18]Liang X H, Chen Z M, Wu H, et al. Carbon, 2014, 80(1): 268

[19]Yu C Y, Chen S, Quan X, et al. J Agric Food Chem, 2009, 57(15): 6927

[20]Candiano G, Santucci L, Petretto A, et al. Anal Chem, 2015, 87(9): 4814

[21]Murkovic M. Anal Bioanal Chem, 2007, 389(1): 139

[22]Barroso A, Gimenez E, Benavente F, et al. Anal Chim Acta, 2013, 804: 167

[23]Zhang H J, Huang J F, Wang H, et al. Anal Chim Acta, 2006, 565(2): 129

[24]Pan Y, Chen W X, Lu S F, et al. Dyes Pigm, 2005, 66(2): 115

[25]Xu Z W, Zhao J S, Li H J, et al. J Power Sources, 2009, 194(2): 1081

[26]Song W W, Luo X L, Li G K, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(1): 20

宋雯雯, 罗夏琳, 李攻科, 等. 色谱, 2017, 35(1): 20

[27]Lin L, Chen H, Wei H B, et al. Analyst, 2011, 136(20): 4260

[28]Liu C C, Deng Q L, Fang G Z, et al. ACS Appl Mater Inter, 2015, 7(36): 20430

[29]Meller K, Pomastowski P, Grzywinski D, et al. J Chromatogr A, 2016, 1440: 45

[30]Zhang M Y, Shao C L, Guo Z C, et al. ACS Appl Mater Inter, 2011, 3(2): 369

[31]Zhu J H, Li Y X, Chen Y, et al. Carbon, 2011, 49(6): 1900