毛立忠 倪勤学 高前欣 许光治 张有做

(浙江农林大学农业与食品科学学院；浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，临安 311300)

菜籽油是我国的一种主要食用植物油，具有饱和脂肪酸低，油酸含量高，且亚油酸、亚麻酸含量合理[1]等特点，除了主要的甘油三酯以外，还含有甾醇、菜籽多酚、生育酚、磷脂、色素、游离脂肪酸等多种微量营养元素[2]。随着生活水平的提高，人们对食品保健功能的要求越来越高。菜籽油中含有多种对人体有特殊生理作用的功能性成分，但菜籽油加工工艺的差别、原料产地等因素对功能成分的种类和含量有影响，需要以功能成分为指标建立菜籽油品质评价标准。另外，功能成分的作用机理也还需要进一步研究。这些都需要菜籽油功能成分萃取方法。现在植物油多酚等功能成分的萃取主要以甲醇为萃取剂，但甲醇是易挥发、易燃、有毒的试剂并不是绿色萃取剂。

低共熔溶剂(Deep eutectic solvents ，DESs)是近年开始研究的一种新型的环境友好型离子溶剂，是由氢受体(季铵盐类等)和氢受体(尿素、多羟基化合物等)组成的混合物，具有蒸汽压低、无毒性、不易燃、可生物降解、溶解性和导电性优良、电化学稳定窗口宽等独特的物理化学性质，并且可以通过选择合适的组成和配比来调节其性能[3],近年来广泛应用于化学相关的多个领域，包括无机材料的制备、有机合成、生物化学和分析化学[4]。随着低共熔试剂的不断开发，有越来越多的研究利用低共熔溶剂分离生物体中的活性成分，包括类黄酮[5]、儿茶素[6]、酚酸[7]、萜类化合物[8]和皂苷[9]。

本研究比较了3种低共熔溶剂(DES)和80%甲醇菜籽油萃取物的抗氧化活性，筛选出最佳萃取剂，并分析了抗氧化成分。以期为植物油微量营养物质的分析和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

菜籽油：市售压榨菜籽毛油；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：Sigma公司；氯化胆碱、乙酰丙酸、尿素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇(色谱纯)：MS1922-001，美国TEDIA公司；福林酚：北京索莱宝科技有限公司；GF254硅胶板：青岛海洋化工厂；甲醇、乙酸乙酯、甘油、正己烷：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

DK-8D电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；1-14离心机：德国SIGMA；UV-1800紫外可见分光光度计、20AT高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 低共熔溶剂制备

用不同的氢供体来制备低共熔溶剂。将这些组分置于带盖的离心管中，在水浴中搅拌加热至80 ℃，直至形成均匀稳定的无色透明液体[10]。制备的低共熔溶剂成分配比及其名称缩写如表1所示。

表1 低共熔溶剂的组成

1.2.2 低共熔溶剂萃取菜籽毛油抗氧化物质

将配好的低共熔溶剂于水浴锅中加热至60 ℃左右，以降低低共熔溶剂的黏度。取5 mL离心管，加入2 mL菜籽毛油，随后加入1 mL相应的低共熔溶剂。充分振荡后，在60 ℃超声锅(70 Hz)中超声10 min,然后在60 ℃的水浴锅中萃取1 h。在萃取期间，将混合物每隔15 min振荡半分钟。随后将两相混合物在5 000 r/min下离心10 min。通过注射器针头扎破离心管，取出极性萃取物(下层相)。

1.2.3 甲醇/水(80∶20)采取菜籽毛油萃取抗氧化物质(对照样品)

取5 mL离心管，加入2 mL菜籽毛油，随后加入1 mL甲醇/水(80∶20)混合，将混合物充分振荡后置于60 ℃超声锅(70 Hz)中超声10 min，然后在60 ℃的水浴锅中萃取1 h。在萃取期间，将混合物每隔15 min振荡半分钟。随后将两相混合物在5 000 r/min下离心10 min。通过注射器直接取出甲醇相(上层相)。

1.2.4 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力实验参考Wang等[11]的方法。取20 μL萃取液加入3.9 mL DPPH(0.101 mmol/L)溶液中，摇匀避光静置30 min。用甲醇对分光光度计调零，于517nm波长下测定吸光值，定为A。3.9 mL DPPH溶液和20 μL甲醇(样品萃取、稀释所用溶剂)为空白对照，测定值为A0，每组样品平行测定3次，通过公式计算DPPH清除率。

清除率=(A0-A)/A0×100%

式中：A0为空白对照吸光值；A为样品吸光值。

1.2.5 总酚含量的测定—Folin酚比色法

总酚的测定参考文献[12]，标准曲线的制作：以没食子酸为标准品，精确称取没5.0 mg,用少量蒸馏水溶解后并定容于50 mL。容量瓶中。取7支10 mL比色管，精确移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的没食指酸标准溶液，各加入6 mL蒸馏水，摇匀后加入0.5 mL福林酚试剂，摇匀，1 min后各加入20%碳酸钠溶液1.5 mL，摇匀定容至10 mL。75 ℃下反应10 min，765 nm波长下测定吸光值[13]。以吸光值为纵坐标，加入样品浓度为横坐标作线性回归，得标准曲线：Y=1.5596X+0.0211，R2=0.998 8。

样品测定：各取0.05 mL萃取物于10 mL比色管中，按上述方法测定样品吸光值，重复3次，根据标准曲线计算相应的总酚含量。

1.2.6 薄层层析(TLC)初步鉴别

菜籽油提取物抗氧化物质TLC初步鉴定参考张志英[14]的方法，实验中采用了GF254硅胶板作为固定相，正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇=9∶9∶2为流动相，0.2 mmol/L的DPPH溶液为抗氧化成分显色剂(成分展开后，清除DPPH自由基能力强的部位显示为白色斑点，反之显示淡紫色)。

样品处理：取5 mL离心管，加入DES-5与80%甲醇萃取物各0.1 mL，0.9 mL蒸馏水用于破坏低共熔体系，1 mL乙酸乙酯反萃。充分振荡混匀后，在70 Hz水浴锅中超声10 min，随后将混合物在5 000 r/min下离心10 min，得乙酸乙酯反萃液，重复2次实验，随后用毛细管将各乙酸乙酯反萃液在硅胶板上点样分析。

1.2.7 HPLC分析条件

萃取物的抗氧化成分HPLC分析参考Liu等[15]的方法，分析柱为C-18柱(Inertsil ODS-SP, 4.6 mm×250 mm,内径5 μm)，高效液相色谱系统为岛津20AT。流动相：溶剂A为含0.1%乙酸酸化的去离子水，溶剂B为含0.1%乙酸的甲醇。上样体积为10μL，流速0.5 mL/min，柱温25 ℃下。HPLC条件：0～10 min溶剂B浓度由10%升至30%，10～30 min溶剂B浓度由30%升至40%，40～50 min溶剂B浓度由40%升至60%，50～55 min溶剂B浓度为100%，55～65 min溶剂B浓度由100%降至10%，并以 10%浓度溶剂B保持到70 min运行完成。

2 结果与讨论

2.1 不同低共熔溶剂菜籽油萃取物抗氧化活性比较

氢供体和氢受体的组成及比例决定了低共熔溶剂物理化学性质，影响了其对溶质的溶解能力[16]。本研究以氯化胆碱为低共熔溶剂的氢受体，以尿素、甘油和乙酰丙酸为氢供体，制备不同的低共熔溶剂，用于菜籽油中抗氧化物萃取。

首先以氯化胆碱∶氢供体比例为1∶2(DES-1、DES-2、DES-3)制备低共熔溶剂，萃取菜籽油中的抗氧化物质，以DPPH自由基清除能力为指标比较了不同溶剂萃取物的抗氧化能力，以80%甲醇萃取物为对照。结果如表2所示，DES-3萃取剂的萃取效果最佳，其萃取能力显著强于80%甲醇萃取物，DPPH自由基清除率比80%甲醇萃取液高了27.29%。DES-1、DES-2从菜籽毛油中萃取抗氧化活性物质的能力显著弱于80%甲醇溶液。

表2 不同溶剂的萃取物的DPPH自由基清除率

注：表中数据与各溶剂萃取物的“清除率平均值±标准差”(n=3)；表中同一列的不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.2 氯化胆碱-乙酰丙酸摩尔比对低共熔溶剂萃取物抗氧化活性的影响

低共熔溶剂氢受体和氢供体摩尔比的不同对其熔点、密度、黏度、物理性质均有较大影响。低共熔溶剂的熔点与其阴阳离子的结构密切相关，阳离子对称性的增加以及阴离子尺寸减小，组分间氢键的形成等因素将使其熔点显著升高[17]，而氢键在低共熔溶剂组件分子之间的相互作用决定了它的高可萃取性和低熔点[18]。

为了研究氯化胆碱与乙酰丙酸不同摩尔比对所形成低共熔溶剂萃取菜籽毛油抗氧化活性物质的影响，根据摩尔比的不同配制了DES-3、DES-4、DES-5、DES-6、DES-7共5种低共熔溶剂，均按照1.2.2的步骤从菜籽毛油中萃取抗氧化活性物质，并比较了抗氧化活性。结果如表3所示，不同摩尔比形成的低共熔溶剂对于菜籽毛油中抗氧化活性成分的萃取无明显差异。由此可见，氯化胆碱和乙酰丙酸的摩尔比的变化对于形成的低共熔溶剂在菜籽毛油中萃取抗氧化活性成分的能力影响不大。氯化胆碱和乙酰丙酸的摩尔比为1∶2时，溶液密度大、黏度高，密度大可以提高溶质的溶解能力但黏度大不利于传质[16]，随着乙酰丙酸的摩尔比增加溶液密度减小、黏度降低，这可能是导致不同低共熔溶剂萃取物抗氧化能力变化不大的原因。

表3 氯化胆碱与乙酰丙酸不同配比形成的低共熔溶剂的

2.3 萃取物中抗氧化活性成分初步鉴别

本研究显示氯化胆碱-乙酰丙酸低共熔溶剂菜籽油萃取物的抗氧化能力显著强于80%甲醇萃取物，这可能由于低共熔溶剂萃取率高于甲醇，或者萃取了更多的抗氧化物质，或兼而有之。为了查明2种萃取物抗氧化能力差异的原因，测定萃取物总酚的含量并用薄层层析-DPPH显色实验初步分析了抗氧化物质的差异。

菜籽毛油的氧化稳定性较好，与多酚类物质含量较高有关[19]。采用Folin酚比色法测定了萃取物总酚的含量，结果表明，菜籽毛油80%甲醇萃取物总酚含量(以没食子酸计)为(1.210±0.046) mg/mL，而DES-5萃取物总酚含量(以没食子酸计)为(1.734±0.028) mg/mL； DES-5萃取菜籽毛油总酚和80%甲醇相比具有很大的优势，总酚比80%甲醇高了43.27%。

为比较两种萃取物抗氧化物质种类的差异，采用薄层层析-DPPH显色实验进行了分析。低共熔溶剂不易挥发，因此萃取物无法直接用于薄层层析。低共熔溶剂是通过氢供体和受体之间通过氢键而形成的溶液，水可以破坏它们之间的氢键。因此，采用加9倍体积水破坏低共熔体系，然后用过乙酸乙酯萃取的方法来解决这个问题。通过这种方法，抗氧化物质的回收率超过92%。

图1 80%甲醇与DES-5萃取物组分分离薄层层析图

从图1结果可知， 80%甲醇萃取物中的抗氧化成分为物质A与物质C，DES-5萃取物中含有物质A、物质B与物质C共3种成分。虽然80%甲醇萃取物中物质C的含量高于DES-5，但几乎没自由基清除能力较强的物质B，这是DES-5提取物自由基清除能力强于80%甲醇的原因之一。

2.4 HPLC结果分析

菜籽油中主要多酚类物质包括Canolol、芥子酸、阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、丁香酸等。在菜籽毛油和冷榨菜籽油中，Canolol是最主要的菜籽多酚[19]。研究表明，Canolol最大吸收峰在275 nm处[20]，芥子酸的检测波长为320 nm[21]，阿魏酸的检测波长为316 nm[22]。为了比较全面分析萃取物多酚的种类和含量，确定275 nm和320 nm为检测波长。

由图2可知，在275 nm波长下，DES-5萃取物的种类明显比80%甲醇萃取物多，化合物“4”、“5”、“7”仅存在于DES-5萃取物中，其中化合物“7”是DES-5萃取物中含量最高的物质。DES-5萃取物中“2”和 “3”等主要化合物的含量也高于80%甲醇萃取物。 Klara等[23]研究了菜籽油精炼过程中酚类物质的变化，发现在菜籽毛油中主要的酚类物质为Canolol，占总酚含量的85%。根据含量和出峰时间，推测化合物“6”很有可能是菜籽多酚Canolol。

图2 80%甲醇、DES-5萃取物在275 nm处的HPLC色谱图

图3 80%甲醇、DES-5萃取物在320 nm处的HPLC色谱图

以320 nm为检测波长的结果由图3可知，DES-5萃取物中化合物“c”的含量比80%甲醇萃取物高53%，化合物“d”的含量比80%甲醇萃取物高了17.6%。此外，化合物“f”、“g”这两种物质仅存在于DES-5萃取物中。

菜籽油中的多酚主要由芥子酸及其衍生物组成。最近，Liu等[15]研究了10种油菜籽中可溶性和不可溶性酚类物质的概况与分布，确定顺式芥子酸的保留时间为26.98 min，1,2-二芥子酰基葡萄糖的保留时间为40.11 min。本实验中的HPLC检测参考了Liu等[15]的方法，测得化合物“b”的保留时间为26.979 min，故推测化合物“b”可能是顺式芥子酸；复合物“d”的保留时间为40.131 min，推测化合物“d”可能为1,2-二芥子酰基葡萄糖。

HPLC分析结果可知，DES-5萃取物中的抗氧化物质的种类与含量均显著高于80%甲醇萃取物，且萃取物总主要的抗氧化成分可能是菜籽多酚Canolol，这与总酚含量测定、薄层层析结果基本一致。表明氯化胆碱-乙酰丙酸形成的低共熔溶剂提取菜籽毛油中微量营养素的能力显著高于80%甲醇，在微营养元素的检测与提取上具有替代80%甲醇的潜力。

3 结论

不同溶剂从菜籽毛油中萃取抗氧化活性成分的能力存在明显差异，氯化胆碱-乙酰丙酸低共熔溶剂在所选的3种以氯化胆碱为氢供体的低共熔溶剂中表现出最好的萃取能力，萃取效果显著优于其他2种低共熔溶剂，且氯化胆碱与乙酰丙酸摩尔比的变化对其形成低共熔溶剂萃取抗氧化物质能力的影响不显著。

氯化胆碱-乙酰丙酸低共熔溶剂与80%甲醇在菜籽毛油萃取液上相比，DPPH自由基清除率高了27.29%，总酚萃取效果提升了43.27%，薄层层析多出了一个明显的抗氧化条带。氯化胆碱-乙酰丙酸低共熔溶剂萃取物中多酚类物质的种类与数量都明显多于80%甲醇萃取物。因此，该溶剂在植物油脂抗氧化成分的萃取和分析中可用于替代甲醇。

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