林 牧，韩晓静，唐 竹，陈云华，陶 雪，石国霰

(贵州航天医院中心实验室，贵州 遵义 563000)

氯吡格雷是一种临床应用广泛的抗凝药物，无论是用于降低急性脑梗死的致残致死率，还是用于急性冠状动脉综合征(ACS)和经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)抗血栓形成，都有显著疗效[1-2]。但该药物发挥抗血小板凝集的药理作用前，必须经过肝脏细胞色素P450 2C19(cytochrome P450 2C19，CYP2C19)的代谢[3]。CYP2C19存在着一定的基因多态性，不同基因型的抗血小板作用也不尽相同，亚洲人群中CYP2C19的变异主要为CYP2C19*2和CYP2C19*3两种基因型，通过以上等位基因的突变降低CYP2C19的酶活性，进而影响氯吡格雷的疗效[4-5]。因此，国内外诸多临床用药指南均建议为需服用氯吡格雷抗血小板治疗的患者行CYP2C19基因测定，从而更好地选择抗血小板药物的种类[6-7]。本研究对141例于我院就诊的冠状动脉综合征行PCI术和突发缺血性脑卒中的患者予以CYP2C19基因型检测，通过比较以上患者服用氯吡格雷前后血小板聚集率和多种高危因素的差异，探讨该基因多态性与氯吡格雷疗效的关系，综合评价CYP2C19基因多态性与氯吡格雷在PCI术后疗效的关系。

1 资料与方法

1.1病例选择：选取2016年1月～2016年12月就诊于贵州航天医院,因冠状动脉粥样硬化性心脏病并行PCI手术或因缺血性脑卒中服用氯吡格雷抗血小板治疗的患者141例为研究对象，其中男105例，女36例；年龄42～81岁，平均64.1岁。以上患者均排除标准严重心力衰竭和肝肾功能损害，无阿司匹林或氯吡格雷治疗禁忌证，生命体征平稳，依从性好，并签署知情同意书。行PCI手术患者，术前每天常规采用氯吡格雷300 mg和阿司匹林300 mg双联抗血小板治疗，术后长期服用氯吡格雷维持剂量75 mg/d[8]；缺血性脑卒中患者先予以氯吡格雷首剂负荷剂量300 mg/d，后给予氯吡格雷75 mg/d维持剂量治疗[9]。

1.2常用试剂及仪器：血液基因组DNA提取试剂盒购置于北京天根生化科技有限公司；人类CYP2C19基因检测试剂盒(PCR荧光探针法)购置于武汉友芝友医疗科技有限公司；CYP2C19基因检测试剂盒及DNA微阵列芯片识读仪等，均购置于上海百傲科技股份有限公司；real time Quantitative - PCR仪7500型购置于美国ABI公司；普利生LBY-NJ4 血小板聚集率测试仪(外送至江苏苏博生物医学股份有限公司代为检测)。

1.3研究方法

1.3.1CYP2C19基因型检测

1.3.1.1PCR检测法：抽取2 ml待检患者术前(服药前)当日的空腹血样本2 ml于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中， 4℃ 冰箱内保存并于24 h 内提取DNA；采用血液基因组DNA提取试剂盒提取待检患者DNA样本(DNA的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度在5～15 ng/μl之间)，-20℃冰箱保存并于24 h内检测；取2 μl DNA样本加入到分装好的CYP2C19基因检测PCR反应管中(CYP2C19* 2上游引物:5′-ATF ACA ACC AGA GCT TGG C-3′，下游引物5′ -AGC AIT ACT CCT TGA CCT GTT-3′；CYP2C19* 3 上游引物：5′-CCA TTA TTT AAC CAG CTA GGC-3′，下游引物5′-AAT GTA CTT CAG GGC TTG G-3′)，按要求上机检测(AB 7500)。

1.3.1.2基因芯片检测法：DNA样本提取同PCR检测法(DNA的A260/A280在1.5～2.0之间，浓度在10～60 ng/μl之间)；取5 μl DNA样本加入到分装好的CYP2C19 PCR扩增反应管中，进行特异性引物聚合酶链反应扩增，将扩增产物与DNA 微阵列芯片一同放入全自动杂交仪中杂交，在通过BE-2.0 DNA微阵列生物芯片识读仪扫描芯片后进行图像分析处理并确定基因型。

1.3.2血小板聚集率检测：抽取待检患者术前(服药前)当日的空腹血样本行血小板聚集率检测，并在PCI术后(服药后)氯吡格雷治疗一周(剂量为75 mg/d)采血复测。采用二磷酸腺苷( Adenosine diphosphate，ADP)(剂量为5 μmol/ L)诱导的光学比浊法对血小板聚集率进行检测，再根据CYP2C19不同基因型所产生的不同代谢类型对以上患者进行分组，比较术前(服药前)与术后(服药后)氯吡格雷治疗一周后血小板聚集率的变化，进而判断CYP2C19基因多态性与氯吡格雷疗效的相关性。

1.3.3高危因素相关性分析：对纳入患者行血糖、血压、三酰甘油(Triacylglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein ，LDL-C)、总胆固醇(Total cholesterol ，CHOL)、B型脑尿钠肽(B type natriuretic peptide，BNP)、肌红蛋白(Myoglobin ，MYO )和肌钙蛋白(troponin，Trop1)等检测，以判断不同代谢类型的患者与以上高危因素的相关性。

1.3.4不同性别、民族的相关性分析：对纳入患者的性别、民族进行统计，以了解不同性别和民族与CYP2C19不同代谢类型之间的相关性。

2 结果

2.1CYP2C19基因分型检测结果：荧光PCR检测法与基因芯片检测法的结果完全一致，根据CYP2C19的不同基因位点(*1/*1、*1/* 2、* 1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3)将以上患者分为快代谢型(EM)、中间代谢型(IM)和慢代谢型(PM)。见表1、图1。

注：A为*1/*1 (636GG,681GG)；B为*1/*2 (636GG,681GA)；C为*1/*3 (636GA,681GG)；D为*2/*2 (636GG,681AA)；E为*2/*3 (636GA,681GA)图1 基因芯片法所确定的基因位点

表1CYP2C19基因型和代谢类型分布情况[例(%)]

基因型分布情况代谢类型∗1/∗1(636GG，681GG)59(4184)快代谢型(EM)∗1/∗2(636GG，681GA)52(3688)中间代谢型(IM)∗1/∗3(636GA，681GG)10(709)中间代谢型(IM)∗2/∗2(636GG，681AA)15(1064)慢代谢型(PM)∗3/∗3(636AA，681GG)0(0)慢代谢型(PM)∗2/∗3(636GA，681GA)5(355)慢代谢型(PM)

2.2CYP2C19 基因多态性与血小板聚集率：根据CYP2C19代谢类型的结果进行分组，比较术前(服药前)与术后(服药后)氯吡格雷治疗一周后血小板聚集率检测结果，含有* 2 或* 3 等位基因的患者，冠心病PCI术后和缺血性脑卒中服药一周后血小板聚集率虽高于野生纯合型，但无论是快代谢型(即*1/*1基因型)、中间代谢型(即*1/*2*和1/*3基因型)或慢代谢型(即*2/*2和*2/*3基因型)血小板聚集率的比较均无统计学意义(P值分别为0.374，0.116和0.067)。见图2。

图2 不同代谢型患者血小板聚集率之间的比较

2.3高危因素对遵义地区人群CYP2C19 遗传多态性的影响：随着生活节奏的不断加快，心脑血管疾病成为损害人类健康的重要原因，高血压、高血脂和高血糖等都是引发心脑血管疾病的危险因素。为了探索以上因素与CYP2C19基因多态性的相关性，本研究根据不同基因型所产生的代谢类型进行分组。见表2。

2.4性别、民族与CYP2C19 基因多态性的相关性：纳入的141名患者中，按性别分类男105例，女36例；按民族分类汉族114例、苗族7例、侗族5例、仡佬族8例、土家族5例、布依族2例。根据不同性别、民族进行代谢类型比较分析，发现其等位基因突变类型间均差异无统计学意义。

表2PCI术后患者不同代谢型相关危险因素的比较[例(%)]

项目快代谢型中间代谢型慢代谢型P值χ2值高血压31(2199)31(2199)11(780)07260819高血糖26(1843)28(1986)11(780)03630577LDL-C19(1348)16(1135)6(426)06970827CHOL19(1348)18(1277)6(426)04260131TG18(1277)23(1631)6(426)01130194BNP9(638)12(851)3(213)06730248

3 讨论

氯吡格雷通过阻断血小板膜蛋白上的P2Y12受体与ADP的结合抑制血小板聚集，发挥较好的抗血小板作用而在临床广泛应用于预防心脑血管事件的发生[11-12]。但最近的研究结果表明，其疗效受多种因素影响，其中CYP2C19基因多态性是最重要因素，在人群中涉及约25个位点，而减弱氯吡格雷疗效的主要为*2和*3等位基因[13]，以上位点在亚洲人群中发生率较高，分别为29%～35%和2%～9%[14-15]。本研究采用PCR和基因芯片检测对2016年于我院心内科行PCI手术和神经内科的缺血性脑卒中患者共141例，结果一致。得出遵义地区人群中发生杂合突变的基因型以*1/*2(636GG,681GA)发生率最高，*3/*3(636AA,681GG)发生率最低的基因分布情况，与张爱玲等人对亚洲健康人群CYP2C19基因型发生率的研究结果[10]相符。

通过ADP诱导的光学比浊法对不同代谢类型的患者进行血小板聚集率检测，该方法作为血小板聚集率检测的“金标准”被广泛应用，赵冠人等的研究结果[16]表明，CYP2C19*2或CYP2C19*3位点的突变可降低ADP对血小板的诱导，发挥抑制血小板聚集的作用。通过观察服药前和服用一周氯吡格雷(剂量为75 mg/d)的血小板反应性，发现含有*2或*3等位基因的患者，服药后的血小板聚集率虽高于野生纯合型，但不同代谢类型间的差异无统计学意义(P>0.05)，这可能与服用氯吡格雷的时间较短和样本量较少有关，为进一步研究这种临床疗效的差别，仍需纳入更多样本和考虑更多因素加以判断。

本研究还通过多种心血管病高危因素(如高血压、高血脂和高血糖等)的科学统计分析，以及多因素(如性别、民族等)综合考虑，全面了解CYP2C19基因多态性可能存在的相关因素。虽实验结果证实以上因素与该基因多态性无直接相关性，但该结果可能与不同地区、不同民族之间的等位基因分布不同有关，且样本量较小对实验结果也存在一定影响。研究结果提示，对心血管性疾病的高发人群，除需要在服药后进行的血小板聚集率的检测外，CYP2C19 基因型的检测对临床也有一定的指导意义，可为患者的联合用药方案或用药计量调整提供参考，能够更为精准地使用抗血小板药物进行临床治疗。

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