陈佳辉 徐志远 汪丽菁 倪益秀 孙建城 程向东⋆

胃癌是病死率最高的恶性肿瘤之一［1］。我国进展期胃癌发病率占胃癌的60%～80%，现有治疗手段5年生存率仅20%［2］。阿帕替尼是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂，主要针对血管内皮细胞上的VEGFR-2受体，通过抑制肿瘤新生血管的形成，达到抗肿瘤的目的［3-5］。研究表明，阿帕替尼在胃癌治疗中能有效延长二期化疗失败患者的无进展生存期（PFS）和总生存率（OS）［6］。2015年12月至2016年5月作者通过实验研究，探讨阿帕替尼通过抑制VEGFR2-PLCERK1/2通路关键蛋白磷酸化，抑制胃癌细胞株MGC-803增殖及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 Forma ClassⅡA2生物安全柜（Thermo美国）；Forma 3111 细胞培养箱（Thermo）；Varioskan Flash多功能酶标仪（Thermo）；SORVALL ST 16R离心机（Thermo）；-80℃超低温冰箱（Thermo）；4℃冰箱（海尔，中国），FACSCantoⅡ流式细胞仪（BD）。ChemiDoc MP全能型凝胶成像分析系统（Bio-Rad）。

1.2 试剂及细胞 阿帕替尼（江苏恒瑞公司）；胎牛血清（Gibco BRL）；RPMI 1640 培养基，PBS（Thermo）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）；CCK-8试剂盒、Annexin VFITC/IP 凋亡检查试剂盒、周期检测试剂盒（康为世纪）。抗β-actin单克隆抗体（Proteintech），抗PKC，p-PKC（α/βⅡThr683/641），p44/42 MAPK（ERK1/2），p-p44/42 MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）和红色上样缓冲液（CST）。MGC-803细胞购自中科院上海细胞库。

1.3 方法 （1）CCK-8法测定细胞毒实验：取对数生长期的MGC-803细胞进行铺板，每孔单细胞悬液180μl（约5000个细胞/孔），接种于96孔板，培养12h后备用。100μM阿帕替尼倍比稀释7个浓度，实验组加入20μl不同浓度的阿帕替尼，空白组加入20μl 1640培养液，培养24h后，用吸引器吸去每孔液体，加入RPMI1640：CCK-8=10：1配置的溶液110μl。置于37℃、5%CO2浓度培养箱中孵育，2h后用酶标仪450nm测定OD值。细胞生存率=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）。所有试验均重复3次。（2）碘化丙啶染色法（Propidium Staining）测定细胞周期：取对数生长期的MGC-803细胞进行铺板，每孔单细胞悬液2ml（6×104/ml），接种于24孔板，置于37℃、5%CO2浓度培养箱中培养12h后，吸去培养液。80μM阿帕替尼倍比稀释5个浓度，各实验组加入2ml含不同浓度阿帕替尼的培养液，空白组加入2ml完全培养液，再培养24h，小心收集细胞培养液及贴壁细胞，冰浴预冷的95%乙醇固定细胞12h后予碘化丙啶染色。流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况，数据经计算机处理，得出细胞各周期比例。（3）Annexin-V/PI双染法测定细胞凋亡：与上述相同方法培养细胞并用阿帕替尼处理后，收集细胞。1000r/min离心5min，沉淀细胞。冰浴预冷的PBS洗涤2次，再次离心沉淀细胞。用去离子水按1∶4稀释Binding Buffer 250μl重悬细胞，调节其浓度为1×106/ml；取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/FITC和10μl 20μg/ml的PI溶液；混匀后于室温避光孵育15min，然后在反应管中加入400μl PBS，流式细胞仪（FACS），分析数据经计算机处理，得出细胞凋亡率。（4）Western blot蛋白印记分析：用细胞裂解缓冲液提取总蛋白，并使用增强型BCA蛋白测定试剂盒对蛋白质浓度进行定量。 蛋白质通过8%的SDS-PAGE分离并电转移至PVDF膜。 将膜用TBS-T中的5%BSA封闭1h，并用相应的一次抗体在4℃下孵育过夜，然后与兔或小鼠二级抗体孵育1h。使用增强型化学发光试剂在放射自显影膜上检测特异性条带。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿帕替尼对MGC803细胞的生长抑制作用 阿帕替尼对MGC803细胞的生长具有明显抑制作用，其抑制效果呈浓度依赖性，IC50值为（27.9±2.21）μM，而在对照组中未观察到抑制作用。见图1。

图1 阿帕替尼对MGC803细胞的生长抑制

2.2 阿帕替尼对MGC803周期的影响 将0、10、20μM的阿帕替尼作用于MGC-803细胞株24h后，碘化丙啶染色法测定细胞凋亡情况，实验组与对照组早期凋亡率差异无统计学意义。见图2。

图2 不同浓度的阿帕替尼对MGC-803细胞周期分布影响的比较

2.3 阿帕替尼对MGC803的凋亡的影响 将80μM倍比稀释的阿帕替尼作用于MGC-803细胞株24h后，Annexin-V/PI双染法测定细胞凋亡情况，实验组与对照组早期凋亡率差异无统计学意义。见图3。

图3 阿帕替尼对MGC-803细胞凋亡的影响

2.4 阿帕替尼抑制VEGFR2-PLC-ERK1/2通路上关键蛋白磷酸化 不同剂量阿帕替尼处理后，tERK1/2、tPLC等蛋白表达水平未发生明显变化，而pERK1/2、pPLC等蛋白表达水平降低。可见阿帕替尼可下调VEGFR2-PLC-ERK1/2通路表达。见图4。

图4 阿帕替尼对pERK1/2、pPLC等蛋白表达的影响

3 讨论

近年来胃癌发病率和病死率逐年下降，但胃癌仍然是一个重要的公众健康问题。据统计，2012年全球胃癌新发病例约951000万例，占所有癌症比例为6.8%。胃癌在中国的发病率居第二，病死率居第三，是中国四大高发肿瘤之一［1，2］。对于无法手术切除、复发或转移性胃癌患者，最佳支持治疗（BSC）预后仅有几个月［7］。现有资料显示，联合化疗虽然能够提高疾病的缓解率和患者生存率，但毒性较高，且获益有限［8］。近年来，多种靶向药物，如抗表皮细胞生长因子受体1（EGFR）和2（HER-2）单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制药和血管生成抑制剂，取得较好的临床效果。相比于传统细胞毒类抗肿瘤药物，分子靶向药物具有高选择性、高效、低毒副作用等特点［3-5］。与其他类型的恶性肿瘤相比，胃癌靶向治疗的发展相对滞后，但仍取得较大进展，雷莫芦单抗已通过FDA认证用于胃癌治疗，并被NCCN指南推荐［9］。

Sui Peng等证实阿帕替尼可通过抑制胆管癌（EBDC）细胞的VEGFR2受体，而抑制肿瘤细胞自分泌VEGF作用，抑制肿瘤的生长［10］。Lin C等发现在小细胞肺癌的治疗中，阿帕替尼不仅通过细胞毒性发挥其抗癌作用，且还通过抑制RET / Src信号通路抑制迁移和侵袭［11］。Mi YJ等发现阿帕替尼可通过抑制转运功能逆转ABCB1和ABCG2介导的肿瘤细胞耐药［12］。

本资料中，与对照组比较，阿帕替尼对胃癌细胞株MGC-803的增殖具有明显抑制作用，IC50值为（27.9±2.21）μM，抑制作用呈浓度依赖性，当浓度为50μM时，其抑制率可达87%。凋亡受阻和细胞周期紊乱是肿瘤发生中的重要因素，因此为初步探讨其可能存在的机制，作者对试验组细胞进行凋亡和周期的检测。诱导细胞凋亡是抗肿瘤治疗中的重要环节，但本研究中，不同浓度阿帕替尼作用后的MGC-803细胞与对照组相比凋亡率无明显区别。因此作者认为阿帕替尼并非通过诱导凋亡抑制MGC-803细胞的生长。同时采用流式细胞仪检测用阿帕替尼处理24h后MGC-803细胞周期分布，结果显示，经阿帕替尼处理后的细胞被明显阻滞于G1期，G2期比例减少，S期细胞无明显变化，差异有统计学意义。

肿瘤细胞的细胞周期紊乱，细胞生长失控，导致细胞无限制增长。化疗药物可将肿瘤细胞的周期阻滞于G0/G1期，抑制分裂相关的蛋白质和DNA合成，从而抑制肿瘤细胞的分裂，发挥抗肿瘤作用［13］。在本资料中，阿帕替尼表现出类似抑制效果，因此作者认为阿帕替尼可通过改变细胞周期发挥抗肿瘤作用。为进一步证实，对VEGFR2下游的VEGFR2-PLCERK1/2通路进行蛋白免疫印迹试验。结果显示，经阿帕替尼处理后，磷酸化的PLC与ERK1/2水平明显下降，且呈浓度依赖性。VEGFR2-PLC-ERK1/2通路被证实与周期调控和细胞增殖关系密切，活化的ERK1/2通过磷酸化激活Jun癌基因（c-Jun），导致DNA合成和细胞增殖［14］。蛋白免疫印迹试验与细胞增殖抑制和周期受阻结果符合。

综上所述，阿帕替尼可抑制胃癌细胞株MGC-803的增殖，并将其阻滞于G1期，从而达到抗肿瘤的效果，且该结果与细胞凋亡无关。引起这一现象的原因，可能是阿帕替尼抑制VEGFR2-PLC-ERK1/2通路关键蛋白磷酸化，造成MGC-803细胞DNA合成受阻，生长受限。此外，用阿帕替尼长期处理MGC803细胞后，会出现肿瘤细胞耐药，将进一步研究。

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