泮俊 裘涛 杨峰 邹莹 陶水良⋆

重症肌无力（Myasthenia gravis，MG）指主要由乙酰胆碱受体抗体介导、细胞免疫依赖、补体参与、主要累及神经肌肉接头突触后膜乙酰胆碱受体的获得性自身免疫性疾病［1］。目前西医治疗主要有胆碱酯酶抑制剂、免疫抑制剂治疗、静脉注射丙种球蛋白、血浆置换、胸腺切除等。这些治疗方法效果均不理想。经作者临床应用，认为马钱子治疗MG有确切疗效［2］。本实验通过检测EAMG大鼠IL-4、IL-6的表达，初步揭示炙马钱子对MG免疫机制的影响，为炙马钱子治疗MG提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）动物：SPF级8周龄Lewis大鼠50只，雌性，体质量220～260g（浙江中医药大学实验动物中心提供）。（2）主要药物：炙马钱子胶囊（200mg/粒，浙江省中医院中药制剂室）；新斯的明注射液（上海信谊金朱有限公司）；阿托品注射液（0.5mg/支，浙江瑞新药业股份有限公司）；强的松片（5mg/片，浙江仙琚制药股份有限公司），实验时用0.2%的梭甲基纤维素钠将其配制成所需浓度的混悬液。（3）主要试剂：鼠源性AChR-a亚基97-116肽段序列（the rat sequence 97-116 of the AChR a subunit，R97-116）、完全福氏佐剂（CFA）、磷酸缓冲液（PBS），大鼠IL-6、TGF-β1、AChRab ELISA检测试剂盒。

1.2 方法 （1）EAMG动物模型建立：本实验参考Tihamer等［3］和许文华等［4］的模型制备法复制EAMG实验动物模型。将R97-116、CFA、PBS三者按1：1.5：1.5的比例充分混匀制成免疫乳剂；首次免疫：取乳剂200μl（含R97-116：100μg）于造模鼠足垫、腹部、背部多点皮下注射，正常对照组（A组）皮下注射等量PBS；首次免疫后第30天及第45天，取乳剂200μl（含R97-116：50μg）强化接种，A组注射等量PBS。（2）模型评估标准：①临床评估：通过测量体重和肌力评价疾病严重性。实验前及接种后2次/周称重，末次免疫2周后观察其摄食、姿势及活动情况。测量肌力（即让鼠重复抓握笼顶30s再测量）采用Berman等［5］的分级法予以临床评分，肌力具体分级为：0级，无肯定的肌无力表现；1级，撕咬无力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少且易疲劳；2级，明显无力，在抓握前就出现震颤、低头、隆背，抓握力弱；3级，在抓握前即有严重的肌无力表现，无力抓握，频死状态；4级，死亡。②新斯的明试验：用腹腔注射法给予新斯的明（37.5μg/kg）和硫酸阿托品（15μg/kg），12min后大鼠肌无力症状可缓解，持续2～12h。（3）实验分组：从50只大鼠中随机取6只为正常组（A组），剩余进行EAMG造模。实验大鼠约于第2次注射后2周左右大鼠陆续发病，分别对大鼠进行模型及临床评估后，将建模成功的大鼠依据模型评估标准均衡随机分为模型组（B组）、阳性药物组（C组）、炙马钱子低剂量组（D组）、炙马钱子中剂量组（E组）、炙马钱子高剂量组（F组）各6只，分笼喂养（自由饮水、摄食）。（4）给药剂量与方法：根据裘昌林［6］在人体中马钱子的用量及动物与人药物剂量的换算公式，分别予以灌胃给药，1次/d，炙马钱子低、中、高剂量组分别以 75mg/（kg·d）、150mg/（kg·d）、225mg/（kg·d）的剂量灌胃治疗，1次/d；阳性药物对照组以强的松4mg/（kg·d）的剂量灌胃治疗，1次/d；正常组、模型组称重后给予药液等量的蒸馏水灌胃，共治疗28d。（5）检测项目及方法：A、B、C、D、E、F各组治疗28d后，禁食12h；采用眼球取血法取静脉血1.5ml，静置30min后，3000r/min，离心10min，取上层血清，放置-20℃冷冻保存待测。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测细胞免疫指标IL-4、IL-6。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示；对于总体分布不明的小样本资料，各组间结果比较采用非参数检验，若符合正态分布且方差齐性用单因素方差分析，样本率的比较用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模前后大鼠肌无力症状阳性率比较 按照Lennon评分法对末次免疫2周后的EAMG大鼠模型进行临床表现评估，结果显示，造模后全部大鼠新斯的明试验阳性，Lennon临床评分0.5～2级，取评分≥1级为肌无力阳性，其中1级大鼠26只，2级大鼠9只，造模前后大鼠肌无力阳性率与造模前比较差异有统计学意义。见表1。

表1 造模前后大鼠肌无力症状阳性率比较［n（%）］

2.2 大鼠一般情况观察 造模第1周，除正常对照组外，其余大鼠出现短暂性肌无力症状，其临床症状未经治疗可自行缓解；第二次免疫后，大鼠出现进食减少，精神萎靡，活动减少等表现，但肌无力表现不典型；追加免疫后，大鼠叫声低弱，对环境刺激反应迟钝，少动，毛发干枯，撕咬无力且易疲劳，蜷缩拱背，四肢肌无力表现比较典型，但无呼吸困难，脱水等危重表现。炙马钱子高剂量组有1只大鼠死亡，最后确定送检标本为A～E各组6只，F组5只。

2.3 各组大鼠体质量变化情况 见表2。

表2 各组EAMG大鼠治疗前后体质量变化差值水平比较［g，（x±s）］

2.4 各组EAMG大鼠血清中IL-4、IL-6含量比较 见表3。

表3 各组EAMG大鼠血清IL-4、IL-6含量的比较［pg/ml，（x±s）］

3 讨论

MG是一种获得性自身免疫性疾病，但MG确切的发病机制至今尚未阐明确。研究表明，其可能是一种由多基因调控、多种机制参与的复杂性疾病［7］。MG的发生与发展涉及多种免疫细胞和细胞因子，其与抗AChR CD4+T细胞的活化，及与B细胞相互作用产生高亲和力的特异性AChR抗体密切相关。根据分泌细胞因子的不同，CD4+T 细胞可分为不同的亚型，其中辅助T细胞（Th1）以分泌白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）为主，促进细胞免疫反应；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6 和IL-10，促进体液免疫反应；而Th3细胞则主要分泌转化生长因子-β（TGF-β），参与免疫抑制机制。特异性AChR抗体通过激活补体系统、促进AChR降解，及AChR功能阻滞等机制损害神经肌肉接头的结构与功能。某些细胞因子水平的变化有助于判断疾病的严重程度、治疗效果和预后，甚至可能找到MG治疗的新方法，应用人工干预以提高某些免疫抑制性细胞因子水平或降低某些促炎性细胞因子水平，可能为MG的治疗提供新的方向。

Th2细胞分泌IL-4、IL-6、等抗炎细胞因子，主要刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫应答相关［8］；IL-4为Th2的特征性细胞因子，主要由活化T细胞产生，可以促进B细胞增殖，使B细胞提呈抗原能力增强，提高巨噬细胞提呈抗原的能力，使其具有杀伤肿瘤细胞的功能。目前IL-4在MG的发病机制中的作用尚不清楚，不同的研究报道有不同的观点。有研究［9］发现MuSK免疫的小鼠中IL-4水平显著升高，并进一步促使抗MuSK抗体滴度升高，从而加重EAMG的症状。本资料中发现经免疫接种后的模型大鼠血清中IL-4含量较空白对照组有明显上升，经药物治疗后其含量有不同程度的下降，差异有统计学意义（P＜0.01），尤其予炙马钱子治疗组血清IL-4样品浓度水平明显降低，其中中、高剂量组较强的松治疗组差异有统计学意义（P＜0.01）。表明炙马钱子可能通过IL-4下调作用起到改善重症肌无力症状的作用。

IL-6由Th2等多种细胞分泌，B细胞终末分化并分泌抗体的必需因子。IL-6还可以诱导T细胞的活化、增殖和分化，促进T细胞表达IL-2R和IL-2［10］。IL-6受体广泛表达于多种组织细胞，作为参与免疫应答的重要炎症介质，在细胞因子网络发挥多种效应。较多疾病中均有IL-6的异常分泌，尤其是一些自身免疫性疾病，IL-6在其中起到诱发和维持免疫炎性反应的功能。研究表明，MG患者血清IL-6水平显著高于对照组，且MG症状改善者其血清IL-6水平也明显下降，表明IL-6在MG发病中起促进作用。用AChR进行免疫，发现IL-6基因缺乏鼠发生EAMG的比例明显低于野型鼠［11］。本实验发现，EAMG模型鼠血清中IL-6含量相比正常组显著升高（P＜0.01），这与大多数文献结果一致。经过药物治疗后IL-6含量出现不同程度的下降，表明炙马钱子和强的松对降低EAMG大鼠血清中IL-6含量均有明确疗效，其中炙马钱子中、高剂量组比强的松组含量更低（P＜0.01），表明中、高剂量的炙马钱子在降低IL-6含量方面治疗效果优于强的松。

马钱子是毒药，且治疗量与中毒量非常接近。尽管在制备过程中使用浸泡、油炒等工序其目的是为了降低药物的毒性［12］，但药物本身超过一定剂量依然可导致药物中毒。在本实验过程中，炙马钱子高剂量组有大鼠在连续给药过程中死亡，原因可能就与药物浓度过高有关。因此，采用炙马钱子治疗重症肌无力时，剂量的判定非常重要，一定范围内的高剂量药物，能够加强治疗效果；反之，毒副作用也相应增加。裘昌林［13］认为马钱子性虽有毒，但只要经过严格炮制、合理地用药，中毒完全可以避免，并总结出“小剂量渐加量法；分次服用，单剂量不＞0.4g；观察药物有效反应，适时调整剂量”的用药经验。

综上所述，炙马钱子能一定程度的降低EAMG大鼠血清中IL-4和IL-6含量，缓解EAMG的病情，其作用机制和强的松相似，属于通过抑制免疫活化而达到治疗效果，且一定剂量范围内的炙马钱子在免疫调节方面的表现优于强的松。

［1］ 重症肌无力诊断和治疗中国专家共识.中国神经免疫学和神经病学杂志,2012,19(6):401-408.

［2］ 裘涛,陈眉.炙马钱子胶囊治疗重症肌无力31例临床观察.中国中医药科技,2008,15(3):219-220.

［3］ Tihamer Orban, Peter Blackburn. Methods for treating autoimmune disease by inducing autoantigen-specific regulatory CD4+ T cells:US,2009.

［4］ 许文华,韩莹莹,汪思应,等.鼠源乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段免疫Lewis鼠诱导实验性重症肌无力模型.中国神经精神疾病杂志,2006,32(2):179-180.

［5］ Berman PW. Experimental Myasthenia Gravis:A Murine System Exp.Med,1980,151:204.

［6］ 裘昌林.马钱子治疗重症肌无力8例.浙江中医杂志,1986,31(1):27.

［7］ Conti-Fine BM,Milani M,Kaminski HJ.Myasthenia gravis: past,present,and future.Clin Invest,2006,116:2843-2854.

［8］ Jutel M,Akdis CA. T-cell subset regulation in atopy. Curr Allergy Asthma Rep,2011,11:139-145.

［9］ Ulusoy C, Kim E, Tuzun E, et al. Preferential production of IgG1,IL-4 and IL-10 in MuSK- immuni zedmice. Cl in Immunol,2014, 151:155-163.

［10］ La Flamme AC,Pearce EJ. The absence of IL-6 does not affect Th2 cell development in vivo,but does lead to impaired proliferation,IL-2 receptor expression,and B cell responses. J Immunol, 1999,162:5829-5837.

［11］ Deng C,Goluszko Z,Tuzun E,et al.Resistance to experimental autoimmune myasthenia gravis in IL-6 deficient mice is associated with reduced germinal center formation and C3 production.Immunol, 2002,15:1077.

［12］ 钱松祥.813胶囊的制备及临床应用.中国中医药科技,2006,13(5):347.

［13］ 裘昌林,金香鸾.马钱子治疗重症肌无力出现毒性反应及预防措施的探讨.中国现代药学应用杂志,1998,15(2):35.